בידוד קרטינוציטים בעור האדם: שיטה לתרבית קרטינוציטים ראשוניים מדגימות עור

תקציר

Johansen, C. et al. יצירה וטיפוח של קרטינוציטים אנושיים ראשוניים מעור בוגר. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מתאר את בידודם של קרטינוציטים – התאים הבולטים ביותר בשכבת האפידרמיס של העור האנושי, על ידי שימוש בשילוב של עיכול אנזימטי ושיטות שיבוש מכני. שיטה זו מסייעת בצמיחה מועדפת של קרטינוציטים על פני סוגי תאי עור אחרים באמצעות מדיום גידול סלקטיבי.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. בידוד קרטינוציטים מעור האדם

1. התחל על ידי ביצוע הפתרונות הבאים: 50 מ"ל פתרון של 0.25% טריפסין ו 0.1% גלוקוז DPBS. מערבבים ומסננים מעקרים (0.2 מיקרומטר) את התמיסה. הכן 10 מ"ל של RPMI-1640 + 2% תמיסת FBS, 50 מ"ל של DPBS ומדיום ללא קרטינוציטים בסרום (KSFM). הוסף תוספי KSFM ו 250 μL של gentamycin ל 500 מ"ל של KSFM. מחממים מראש את התמיסות ל-37°C לפני השימוש.
2. איסוף עור ממתנדבים בוגרים בריאים שעוברים ניתוחים פלסטיים. דגימות העור המשמשות הן בערך 10 ס"מ x 15 ס"מ אבל יכול להשתנות בגודל. יש לשמור על קירור העור תחת הובלה על ידי הובלת דגימות העור בקופסת קלקר המכילה חומר קירור. במידת הצורך, ניתן לאחסן את דגימת העור ב -4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
3. הסירו שומן מתחת לחלק העור באמצעות מספריים, אזמלים ומלקחיים מעוקרים.
4. יש לחגור את מקטע העור (כ-10X15 ס"מ) על כיסוי סטרילי על גבי צלחת באמצעות מחטים. ראשית, נקו את העור עם פד גזה מעוקר יבש. לאחר מכן, לנקות את העור באמצעות פד גזה מעוקר עם 70% אתנול.
5. בעזרת פלנר לרגליים, חותכים את השכבה העליונה (אפידרמיס) של חלק העור ומכניסים אותה לצלחת פטרי בקוטר 9 ס"מ. לאחר מכן, הוסף מיד 25 מ"ל של תמיסת DPBS/טריפסין/גלוקוז (שהוכנה בשלב 1.1) לצלחת הפטרי. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C.
6. באמצעות פיפטה, הסר את תמיסת DPBS/טריפסין/גלוקוז מצלחת הפטרי והוסף 10 מ"ל של RPMI-1640 + 2% FBS כדי להשבית את הטריפסין.
7. באמצעות שתי מלקחיות, כעת שחררו את תאי האפידרמיס לתוך המדיום על ידי גירוד עדין והתסיסה הן את האפידרמיס והן את תא העור של חלקי העור.
8. מסננים את תרחיף תאי האפידרמיס דרך מסנן מתכת (גודל חור של 1 מ"מ), ואוספים בצינור של 50 מ"ל. הוסף את חלקי העור הנותרים לצינור 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של RPMI-1640 ללא FBS ומערבולת למשך 10 שניות. סנן את המתלה דרך מסנן המתכת לתוך צינור 50 מ"ל המכיל את תרחיף תאי האפידרמיס. הוסף DPBS לנפח כולל של 50 מ"ל.
9. צנטריפוגה את מתלה התא למשך 10 דקות ב 450 x גרם בטמפרטורת החדר.
10. הסר את supernatant ו resuspend את גלולת תא האפידרמיס כ 10 מ"ל של 37 ° C KSFM בהתאם לגודל של גלולת התא. ספרו את התאים בשיטת הצביעה Trypan Blue תחת מיקרוסקופ. מספר התאים המתקבלים מחתך עור בגודל 10 ס"מ x 15 ס"מ הוא כ 50-100 x 10⁶ תאים. לכל 75 ס"מ² צלוחיות תרבית, להעביר 8 x 10⁶ תאים יחד עם 12 מ"ל של 37 ° C KSFM. נערו בעדינות את צלוחיות התרבית כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים.
11. לדגור את הקרטינוציטים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 100% לחות ו-5% CO₂. שנה את המדיום לאחר יומיים ושלוש פעמים בשבוע. תאי מעבר כאשר התרבית היא 70-80% confluent, אשר לוקח בערך 2 שבועות בהתאם לקצב ההתפשטות של keratinocytes.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
KSFM	תרמופישר סיינטיפיק	17005-034	מדיום תרבית תאים
תוספי KSFM	תרמופישר סיינטיפיק	37000-015	תוספי מזון עבור KSFM
DPBS	תרמופישר סיינטיפיק	14190-144	DPBS ללא סידן ו מגנזיום
DMSO	סיגמא-אולדריץ'	D8418	דימתיל סולפוקסיד
ג'נטמיצין	תרמופישר סיינטיפיק	15710-049	תוסף בינוני לתרבית תאים
מסנן עיקור	סרטוריוס	16534	מסנן מזרק עם גודל נקבוביות של 0.2 מיקרומטר
טריפסין	סיגמא-אולדריץ'	T7409	משמש כדי tripsinize תאים
גלוקוז	סיגמא-אולדריץ'	G7528	-
RPMI-1640	תרמופישר סיינטיפיק	61870-010	-
פ.ב.ס.	תרמופישר סיינטיפיק	16000044	משמש כדי להשבית טריפסין
מלקחיים	-	-	מלקחיים מכל חברה יכולים להיות להשתמש
מספריים	-	-	מספריים מכל חברה יכולים להיות להשתמש
אזמל	סוואן מורטון	0501	אזמלים מכל חברה יכולים להיות להשתמש
70% אתנול	-	-	-
רפידות גזה	NOBAMED	875420	רפידות גזה מכל ספק יכול לשימוש
מתכנן רגליים	קרדו זולינגן	1510	מתכנן רגליים מכל ספק יכול לשימוש
צלחות פטרי	TPP	93100	מנות פטרי מכל ספק יכול < br / > לשימוש
מסנן מתכת	-	-	בתוך הבית 1 מ"מ חור בגודל מתכת מסנן
75 ס"מ2 צלוחיות תרבות	NUNC	156499	-
150 ס"מ2 צלוחיות תרבות	TTP	90151	-
0.05% תמיסת טריפסין-EDTA	תרמופישר סיינטיפיק	25300-062	משמש לטריפסיניזציה של תאים כאשר פס"ד