בידוד תאי גזע מלנומה: שיטה להשגת תאי מלנומה חיוביים ושליליים CD133 באמצעות מיון תאים המופעלים מגנטית

1. מיון תאים מגנטיים של CD133⁺ ו- CD133^- תאי מלנומה באמצעות עמודות LS

1. הכן מאגר MACS המכיל 2 mM EDTA ו- 5% FCS ב- PBS. יש לערבב על-ידי היפוך וחיץ סטרילי-תסנין באמצעות יחידת סינון סטריטופ-GP בגודל 0.22 מיקרומטר. יש לצנן את החיץ ל-4-8°C ולנטרל את הגז לפני השימוש.
2. מחממים מראש את Accutase, PBS ו-Quantum 263 בינוני עד 37°C.
3. יש לשטוף 80% תאים מתמזגים עם PBS. מוסיפים כמות מתאימה של Accutase ודוגרים עד שהתאים מתנתקים מפני השטח של התרבית. איסוף תאים בצינור של 50 מ"ל באמצעות תווך קוונטי 263.
4. קבע את מספר התא והצנטריפוגה את מספר התאים הנדרש למשך 5 דקות ב- 300 x g ו- 4-8 ° C. (על פי הפרוטוקול של Miltenyi, ניתן לטעון מקסימום 2x 10⁹ תאים לכל עמודת LS. יש לקבוע מספרים אופטימליים ספציפיים לקו התא ויכולים להיות נמוכים במידה ניכרת.) לשאוף סופרנאטנט לחלוטין.
5. השהה מחדש לכל היותר 1x 10⁸ תאים עם מאגר MACS של 350 μL (למספרי תאים גבוהים יותר, הרחב את כל אמצעי האחסון הבאים של MACS, מגיב חסימת FcR, CD133/1-Biotin, ונגד ביוטין MicroBeads בהתאם).
6. הוסף 100 μL מגיב חסימת FcR.
7. הוסף 50 μL CD133/1-ביוטין. מערבבים היטב באמצעות מערבולת ודגרים בטמפרטורה של 4-8 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
8. לשטוף תאים על ידי הוספת 10 מ"ל MACS חיץ וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 x גרם ו 4-8 ° C. לשאוף supernatant לחלוטין.
9. חזור על שלב הכביסה (1.8).
10. גלולת תא השהיה מחדש עם מאגר MACS של 400 μL.
11. הוסף 100 μL נגד ביוטין MicroBeads. מערבבים היטב באמצעות מערבולת ודגרים בטמפרטורה של 4-8 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
12. בינתיים, הכינו את מפריד MACS להפרדה מגנטית. חבר QuadroMACS למעמד מרובה מפריד MACS. הכנס את המספר הנדרש של עמודות LS עם כנפי העמודות לחזית בשדה המגנטי של QuadroMACS. הניחו מסנן קדם-הפרדה (עם רשת ניילון של 30 מיקרומטר) בכל עמודת LS וצינור איסוף מתאים (15 מ"ל או 50 מ"ל) מתחת לכל עמודה. הכן מסנן ועמודה על ידי שטיפה עם מאגר MACS 3 מ"ל. יש להשליך את הזרימה.
13. לשטוף תאים על ידי הוספת 10 מ"ל MACS חיץ וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 x גרם ו 4-8 ° C. לשאוף supernatant לחלוטין.
14. השהה מחדש תאים עם מאגר MACS של 500 μL והחל את השעיית התאים על עמודת LS באמצעות מסנן קדם-הפרדה.
15. שטפו שלוש פעמים עם מאגר MACS של 3 מ"ל לכל עמודה. הוסף את המאגר הטרי רק כאשר מאגר העמודות ריק.
16. סך כל השפכים שנאספו מכיל את מקטע התאים CD133 ללא תווית.
17. השליכו את מסנן קדם-ההפרדה, הסירו את העמוד מהמפריד והניחו אותו על צינור איסוף מתאים.
18. החל מאגר MACS של 5 מ"ל. שטוף מיד את תאי CD133⁺ המסומנים על ידי דחיפת הבוכנה בחוזקה לתוך העמודה.
19. כדי להגביר את טוהר המקטע השלילי, החל את מתלה התא על עמודת LS מאוזנת חדשה המוכנסת ל- QuadroMACS. הקולחים מכילים את החלק CD133.
20. מחק את העמודות.