מודל קרצינוגנזה דו-שלבית של העור המושרה על ידי כימיקלים: מודל ניסיוני של סרטן העור בעכבר Vivo

תקציר

מקור: Vähätupa, M. et al. מודל קרצינוגנזה של עור המושרה על ידי כימיקלים באמצעות dimethylbenz[a]Anthracene ו 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-אצטט (DMBA-TPA). J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מתאר את ההליך לגרימת סרטן עור דו-שלבי כדי לחקור את התחלת הגידול על ידי יישום מקומי של כימיקלים. בשלב הראשון, מוטגן, DMBA, מוחל על העור של מודל עכבר אשר יוזם היווצרות הגידול על ידי גרימת מוטציות בתאי הגזע, ואחריו יישום של ממריץ גדילה, TPA, אשר מאיץ היווצרות פפילומה העור.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. חיות ניסוי, ריאגנטים וציוד

1. השתמשו בעכברים תואמי גיל ומין. התחילו את המחקר בגיל 7-9 שבועות מכיוון שהעור ברוב העכברים נמצא בטלוגן (שלב המנוחה) בסביבות גיל זה.
2. שימו לב להתנהגות של בעלי החיים במהלך המחקר ואם הם נלחמים, מה שקורה לעתים קרובות עם זכרים, לשכן אותם בנפרד. קרבות עלולים לגרום לחתכים בעור, המעודדים היווצרות גידולים. נקבות עכברים מועדפות בשל התנהגותן הפחות תוקפנית. גודל קבוצת הניסוי הטיפוסית נע בין 8-20 בעלי חיים לקבוצה.
   הערה: חישובי כוח המבוססים על השונות הביולוגית שנצפתה במחקרים קודמים מסייעים לבחור גודל קבוצה גדול מספיק. הזנים המשמשים כדוגמאות במאמר זה כוללים Balb/c ו- C57BL/6. עם זאת, זני עכברים רבים אחרים, כגון SENCAR ו- FVB, שימשו עם דגם DMBA-TPA וחולדות Wistar ו- Sprague-Dawley. יש צורך ברישיון מהוועדה הארצית או המקומית לעבודת בעלי חיים לפני תחילת המחקר. בנוסף לשיקולי רווחה כלליים, נקודות הקצה הספציפיות למודל הן בדרך כלל קרצינומה של תאי קשקש (SCC) וזיהום של העור. שריטות בעור עקב גירוד לאחר החלת כימיקלים גידוליים אצטון אופייניים, אבל אחרת, בעלי החיים לא צריך להראות סימנים של אי נוחות. שקילה קבועה (למשל, 2 פעמים בחודש) מסייעת להעריך את רווחת בעלי החיים.
3. השתמש DMBA ו TPA, שניהם מדוללים אצטון. ריכוז העבודה של DMBA הוא 250 גרם / ליטר. מינון עבור חיה אחת הוא 50 מיקרוגרם של DMBA ב 200 μL של אצטון. ריכוז המלאי של TPA הוא 125 גרם / ליטר וריכוז הטיפול 25 גרם / ליטר. מנת TPA עבור חיה אחת היא 5 מיקרוגרם ב 200 μL של אצטון.
   אזהרה: DMBA מזיק בבליעה ועלול לגרום לסרטן. אצטון מתאדה במהירות והוא דליק. זה עלול לגרום לסחרחורת ולגרות את העיניים. השתמשו במסכת נשימה ו/או עבדו תחת זרם ואקום. החליפו כפפות לאחר הטיפול בכל אחד מהכימיקלים הללו. כלובים מאווררים בנפרד מונעים את התפשטות הכימיקלים במהלך שיכון העכברים. לאחר היישום, לאסוף את טיפים פיפטה המשמשים לטיפול DMBA ולהשליך אותם כפסולת מסוכנת.
   הערה: ה- DMBA חייב להיות מוגן מפני אור. TPA מדולל מאוחסן ב -20 ° C, רצוי מוגן מפני אור.
4. רכשו את הציוד הבא: מאזניים, מכונת גילוח רגילה לפרווה, פיפטות וקצוות בגודל מתאים, סרגל רגיל, מצלמה דיגיטלית, פנקס ועט או מחשב להקלטת הפפילומות, מערכת הרדמה בשאיפה או ריסון עכבר עם פתח בחלק האחורי, ומערכת נרקוזיס פחמן דו חמצני להקרבת עכברים.

2. זירוז וקידום פפילומה של העור

1. לגלח את העור האחורי ולשקול את החיה. מאוחר יותר, יש לגלח את העור בעת הצורך, אך לא בזמן החשיפה לכימיקלים.
   הערה: היזהר בעת גילוח סביב הפפילומות ולהימנע מביצוע חתכים על העור. שקלו כל חיה כל שבועיים כדי להבחין בכל ירידה פוטנציאלית במשקל.
2. יש למרוח 50 מיקרוגרם DMBA ב-200 מיקרוליטר אצטון באופן מקומי על האזור המגולח באמצעות פיפטה 48 שעות לאחר גילוח הפרווה. במידת הצורך, יש לרסן את בעל החיים באמצעות הרדמה קלה או ריסון עכבר.
3. לאחר 7 ימים, לתת את מנת TPA הראשונה. יש למרוח 5 מק"ג TPA ב-200 מיקרוליטר אצטון באופן מקומי עם פיפטה 2 פעמים בשבוע, רצוי בימים שני וחמישי או שלישי ושישי.
4. לספור, להקליט ולצלם את הפפילומות מדי שבוע. מסה מוחשית בקוטר של יותר מ -1 מ"מ נחשבת לפפילומה אם היא נשארת יותר משבוע. סמן כל פפילומה בנפרד על מפה ורשום את גודלה מדי שבוע - אחסן תמונות דיגיטליות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
7,12-דימתילבנץ[a]anthracene (DMBA)	סיגמא	D3254-100MG	מזיק בבליעה ועלול לגרום לסרטן. יש לאחסן מוגן מפני אור.
אצטון	סיגמא	1000141011	מתאדה במהירות ודליק.
וטרינר אטאן 1000 מ"ג/גרם	Piramal טיפול קריטי מוגבלת		איזופלורן נוזלי לשאיפה
קוצץ איזיס המופעל באמצעות סוללה	אלברט Kerlb GmbH	GT421	לגילוח הפרווה
CONTRAfluran-Restgasfilter	ZeoSys GmbH		להרדמה
Linex Nature N1030 סרגל 30 ס"מ	יתרון עסקי בסיסי	60383	למדידת פפילומות
טאקטה פיפטה 100-1000 ul	סרטוריוס	LH-729070
טאקטה פיפטה 20-200 ul	סרטוריוס	LH-729060
Phorbol 12-myristate 13-אצטט aka 12-Otetradecanoylphorbol-13- אצטט (TPA)	אנזו	BML-PE160-0001
מקסופט	מקלסי	23008	כריכת שולחן
איזון מדויק PLJ-C/PLJ-G	קרן & סון GmbH	PLJ 600-3CM
עכברים (Balb/c JRj)	מעבדות Janvier		זנים אחרים אפשריים גם
עכברים (C57BL/6JRj)	מעבדות Janvier		זנים אחרים אפשריים גם
Panasonic Lumix DMC-FS5 מצלמה דיגיטלית	פנסוניק

כן כן