כל ההליכים המערבים בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. בידוד מלנוציטים ופיברובלסטים
- יש להרדים גורי C57Bl/6J זכרים ו/או נקבות בני 0 עד 4 ימים על ידי עריפת ראש, ולהסיר גפיים מהעכברים שעברו המתת חסד באמצעות מספריים כירורגיים.
- בארון זרימה למינרית, גלגלו לזמן קצר את תא המטען של כל עכבר בצלחת פטרי סטרילית המכילה 70% אתנול. מוציאים את תא המטען מהאתנול ומניחים אותו בצלחת פטרי ריקה וסטרילית.
- באמצעות מספריים כירורגיים, מעוקרים באתנול 70%, לבצע חתך בעור בצד הגחוני של תא המטען החל מהצוואר ועד הזנב. מקלפים את העור מתא המטען של העכבר באמצעות מלקחיים סטריליים.
- מניחים את העור, דרמיס כלפי מטה, בכלי 6 בארות המכיל 3 מ"ל של 1x תמיסה אנטיביוטית/אנטי-מיקוטית ודגורים בטמפרטורת החדר למשך 2-3 דקות.
- הפעל את מסוק הרקמות עם ההגדרות הבאות במקום: עובי פרוסה: 1 מיקרומטר; כוח להב: ~ 60% מהמקסימום; מהירות: ~ 50% מהמקסימום.
- מעבירים את העור, הדרמיס כלפי מטה, לדיסק מסוק רקמות סטרילי ומעבירים את העור במלואו דרך מסוק הרקמה הפעיל 3 פעמים.
- העבירו את העור ההומוגני לצינור חרוטי סטרילי בנפח 15 מ"ל המכיל 3 מ"ל של חיץ לעיכול העור (הכינו 3 מ"ל של חיץ עיכול עור טרי המכיל 10% סרום בקר עוברי, 1% תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין, 1% L-גלוטמין, 10 מ"ג/מ"ל קולגן מסוג I, 0.25% טריפסין חזירי ו-0.02 מ"ג/מ"ל דאוקסיריבונוקלאז I בסל"ד 1640). ערבבו את המתלה שנוצר על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10-15 פעמים עם מיקרופיפטה P1000.
- מכסים את הצינור החרוטי ודגרים על הדגימה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, תוך היפוך הצינור כל 3-5 דקות.
- גלולה התאים בעור הומוגניים על ידי צנטריפוגה צינור חרוטי ברוטור דלי מתנדנד ב 750 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- באמצעות מיקרופיפטה P1000, לאט ולחלוטין להסיר את מאגר העיכול העור, נזהר לא להפריע את הכדור.
הערה: בשלב זה ניתן להציל חלק מהעור כולו ולהשתמש בו כבקרה לאישור טוהר התאים. מסננים תאים אלה באמצעות מסננת תאים של 70 מיקרומטר ותהליך נוסף.
- השהה מחדש ביסודיות את גלולת התא ב 1 מ"ל של מלנוציטים מדיה על ידי pipeting למעלה ולמטה 15-20 פעמים עם micropipette P1000. הוסף את תמיסת התא המתקבלת טיפה לבאר לא מצופה של צלחת 6 בארות המכילה 1 מ"ל של מלנוציטים מדיה.
- הניחו את העור המצופה הומוגנט באינקובטור של תרבית רקמה בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2. אפשר לתרביות לדגור במשך 40 דקות.
הערה: במהלך תקופה זו, כמה fibroblasts בעור homogenate יהיה לדבוק צלחת uncipated בעוד מלנוציטים ו keratinocytes להישאר השעיה.
- מעבירים את הסופרנאטנט התרבית מהתבשיל הלא מצופה לבאר אחת של צלחת 6 בארות שטופה מראש ומצופה קולגן. הוסף G418 למדיה כך שהריכוז הסופי הוא 100 ננוגרם/מ"ל.
- הוסף 2 מ"ל של מדיה פיברובלסט לבאר אחת של צלחת לא מצופה, המכילה כעת פיברובלסטים דבקים.
- יש לדגור על שתי התרביות למשך הלילה באינקובטור תרביות רקמה בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
- שאפו בנפרד את המדיה ואת כל הפסולת מכל תרבות, 16-24 שעות לאחר הציפוי. שטפו כל צלחת פעמיים עם 1 מ"ל של PBS סטרילי, ולאחר מכן הוסיפו 2 מ"ל של מדיה מלנוציטים טריים בתוספת 100 ng/mL G418 לתרבית המלנוציטים ו-2 מ"ל של מדיה פיברובלסט טרייה לתרבית הפיברובלסט. (הכינו 6 מ"ל של מצע מלנוציטים טרי המכיל 10% נסיוב בקר עוברי, 7% נסיוב סוסים, 1% תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין, 1% L-גלוטמין, 0.5 mM די-בוטיריל מחזורי AMP (dbcAMP), 20 ננומטר tetradecanoylphorbol 13-אצטט (TPA) ו-200 pM רעלן כולרה (CT) בתערובת חומרים מזינים F-12 Ham's media.
הערה: ניתן לייצר, לייצר פתרונות מלאי מרוכזים של dbcAMP, TPA ו-CT במשך > שנה בטמפרטורה של -80°C. ניתן לאחסן מדיה בסיסית חסרה רכיבים אלה למשך עד חודש אחד ב- 4 °C.
הכינו 4 מ"ל של מדיית פיברובלסט המכילה 10% נסיוב בקר עוברי, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-1% L-גלוטמין במדיום הנשר המעובד של דולבקו. ניתן לאחסן מדיה זו ב- 4 ° C למשך עד חודש אחד)
- לאחר שתרביות המלנוציטים טופלו ב-G418 במשך 48 שעות, שטפו את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של PBS סטרילי והוסיפו 2 מ"ל של מדיה מלנוציטית טרייה ללא G418 לתרבית.
הערה: כאשר פיברובלסטים בתרבית המלנוציטים ממשיכים למות לאחר טיפול G418, שטפו את הכלים עם PBS סטרילי כדי להסיר תאים מתים ולהוסיף מדיה מלנוציטים טריים. תרביות מלנוציטים ופיברובלסטים צריכות לעבור כאשר הן מגיעות למפגש של 70-80%.
