רקומביננטי תא פוליומה פוליומה וירוס (MCPyV) הכנת ויריון: טכניקה לייצור טיטר גבוה רקומביננטי MCPyV Virion

תקציר

מקור: Wei Liu et al. Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection, J. Vis. Exp. (2019)

בסרטון זה אנו מראים את ההכנה של נגיף פוליומה של תאי מרקל או נגיפים MCPyV באמצעות תאי 273TT. טכנולוגיה זו מסייעת לייצר טיטר גבוה של נגיפים MCPyV רקומביננטי.

פרוטוקול

1. הכנת נגיפים רקומביננטיים MCPyV

1. עיכול 50 מיקרוגרם של פלסמיד pR17b (הנושא גנום MCPyV) עם 250 U של BamHI-HF בנפח 200 μL (4 שעות ב-37°C) כדי להפריד את הגנום הנגיפי מעמוד השדרה הווקטורי (איור 1).
2. הוסף 1200 μL של PB חיץ (בתוספת 10 μL של 3 M NaAc, pH 5.2) לדנ"א המעוכל וטיהר מעל 2 עמודות ספין miniprep (קיבולת DNA 20 מיקרוגרם). הצביעו על פלסמיד pR17b מעוכל מכל עמודה עם 200 μL של חיץ TE (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 1 mM EDTA).
3. הכן את תגובת הקשירה בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל. הוסף 400 μL של DNA פלסמיד מטוהר משלב 1.2, 8.6 מ"ל של 1.05x T4 ligase buffer ו 6 μL של ריכוז גבוה T4 ligase. לדגור ב 16 °C (75 °F) במשך הלילה.
4. הוסף 45 מ"ל של PB חיץ (בתוספת 10 μL של 3 M NaAc, pH 5.2) לקשירה והשתמש בסעפת ואקום כדי לטעון דרך 2 עמודות ספין miniprep. הצביעו על כל עמוד עם 50 μL של מאגר TE. צפו לתנובה של כ-30 מיקרוגרם DNA.
5. בשעות אחר הצהריים המאוחרות / ערב, זרעו 6 x 10⁶ 293TT תאים לתוך צלחת 10 ס"מ המכילה DMEM בינוני בתוספת 10% סרום עגל עוברי, 1% חומצות אמינו לא חיוניות, ו 1% L-גלוטמין ללא היגרומיצין B.
6. למחרת בבוקר, ודא כי התאים הם כ 50% זורמים. Transfect באמצעות 66 μL של מגיב transfection (1.1 μL / cm²), 12 מיקרוגרם של MCPyV re-ligated לבודד R17b DNA משלב 1.4, 8.4 מיקרוגרם של פלסמיד ביטוי ST pMtB ו 9.6 מיקרוגרם של פלסמיד ביטוי LT pADL.
7. כאשר התאים הנגועים כמעט נפגשים, למחרת, טריפסינזציה של התאים והעברתם לצלחת של 15 ס"מ להמשך הרחבה.
8. לחלופין, קח מספר קטן של תאי 293TT עם ההרחבה ובצע צביעת IF עבור MCPyV LT (CM2B4) ו- VP1 (ארנב MCV VP1) כדי לקבוע את יעילות ההעברה. בשלב זה, אותות LT גרעיניים עשויים להיות גלויים, אך ביטוי VP1 כנראה לא יהיה ניתן לגילוי.
9. כאשר התבשיל בקוטר 15 ס"מ הופך כמעט למפגש (בדרך כלל 5-6 ימים לאחר ההעברה הראשונית), מעבירים את התאים לשלוש מנות בקוטר 15 ס"מ. קצרו את התאים מהכלים בקוטר 15 ס"מ כאשר הם הופכים כמעט נפגשים ועקבו אחר פרוטוקול קציר הנגיף להלן.
   הערה: לחלופין, בצע בקרת איכות IF כמתואר בשלב 1.8. רוב התאים צריכים להיות גם MCPyV LT וגם VP1 חיוביים בשלב זה.
10. כדי לקצור את הנגיף, טריפסיניזציה של התאים, מסתובבים ב 180 x גרם במשך 5 דקות ב RT ולהסיר את supernatant. הוסף נפח כדורי תא אחד של DPBS-Mg (DPBS עם 9.5 mM MgCl₂ ו-1x אנטיביוטי-אנטי-מיקוטי). לאחר מכן, הוסף 25 mM אמוניום סולפט (מתמיסת מניות 1 M pH 9) ואחריו 0.5% Triton X-100 (מתמיסת מלאי 10%), 0.1% בנזונאז ו-0.1% DNase תלוי ATP. יש לערבב היטב ולדגור על טמפרטורה של 37°C למשך הלילה.
11. דוגרים על התערובת במשך 15 דקות על קרח ולאחר מכן מוסיפים נפח 0.17 של 5M NaCl. מערבבים ודוגרים על קרח עוד 15 דקות. סחרור במשך 10 דקות במהירות של 12,000 x גרם בצנטריפוגה של 4°C. אם הסופרנאטנט אינו ברור, הפוך בעדינות את הצינור וחזור על שלב הסיבוב. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור חדש.
12. השהה מחדש את הגלולה באמצעות נפח אחד של DPBS בתוספת 0.8 M NaCl, וסחרור שוב, כמתואר בשלב 1.11.
13. שלב את הסופרנאטנטים משלב 1.11 ו-1.12, וסובב פעם נוספת כמתואר בשלב 1.11.
14. יוצקים שיפועים של יודיקסנול בקיר דק 5 מ"ל צינורות פוליאלומר על ידי שכבה תחתונה (27%, ואז 33%, ואז 39%) ~ 0.7 מ"ל צעדים באמצעות מזרק 3 מ"ל מצויד מחט ארוכה או פיפטה p1000.
15. טען 3 מ"ל של supernatant מובהר המכיל וירוס על שיפוע יודיקסנול מוכן.
16. סחרור במשך 3.5 שעות במהירות של 234,000 x גרם ו- 16° צלזיוס ברוטור SW55ti. הגדר את התאוצה וההאטה להאטה.
17. לאחר אולטרה-צנטריפוגה, לאסוף 12 שברים צינורות סיליקון (כל שבר הוא ~ 400 μL).
18. נתח את השברים לנוכחות וירוס על ידי מגיב dsDNA ו / או כתם מערבי עבור VP1 (ארנב MCV VP1). אסוף שברים הדרגתיים עם תוכן שיא dsDNA ו / או VP1 ואפיין את המניה על ידי PCR כמותי כדי לחשב את המקבילה הגנומית הנגיפית. יש לאחסן מלאי נגיפים MCPyV בטמפרטורה של -80°C.

תוצאות

איור 1. ייצור נגיפים MCPyV באמצעות גנום נגיפי רקומביננטי.(A) מפת פלסמיד של pR17b (פלסמיד גנום MCPyV). (B) תמונה מייצגת של דגימת נגיפים MCPyV שנקטפה וטוהרה על גבי שיפוע. חץ מסמן את הרצועה של נגיפים MCPyV מרוכזים בליבת השיפוע. (C) מספר העתק הגנום הנגיפי בכל מקטע הדרגתי כומת באמצעות qPCR. שברי מעבר צבע ליבה (מספרים, ספירה מראש מעבר הצבע, מסומנים בתחתית ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM/F12 בינוני	תרמו פישר סיינטיפיק	11330-032
חלבון EGF אנושי רקומביננטי, CF	מערכות מו"פ	236-EG-200	יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס
CHIR99021	קיימן כימיקל	13122	יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס
CHIR99021	סיגמא	SML1046	יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס
Collagenase סוג IV	תרמו פישר סיינטיפיק	17104019
דיספאס השני	רוש	4942078001
אנטיביוטיקה-אנטי-מיקוטית	תרמו פישר סיינטיפיק	15240-062	הגנה מפני אור
מדיום DMEM	תרמו פישר סיינטיפיק	11965084
פרפורמאלדהיד	סיגמא	עמ' 6148
אנטי-MCPyV LT (CM2B4)	סנטה קרוז	SC-136172	פריט # B2717
ארנב MCV VP1		סרום רב-שבטי ארנב #10965	https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm