הדמיית ביטוי חלבון מבוססת קובייה: הליך להדמיית ביטוי חלבון בעובי מלא ביופסיות עור עכבר

כל ההליכים המערבים בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת רקמת העור של העכבר השקוף

הערה: כל העכברים ששימשו במחקר זה היו על רקע גנטי C57BL/6

1. אוסף רקמת עור עכבר.
   1. המתת חסד אנושית של העכברים על ידי פריקת צוואר הרחם.
   2. יש להסיר בזהירות שערות מאזור העור הרלוונטי בעזרת גוזם המקפיד שלא לפצוע את העור.
   3. יש לשטוף את העור כדי לטהר עם 70% אתנול במי מלח חוצצים פוספט (PBS).
   4. להרים את עור הצוואר הגבי עם מלקחיים ולעשות חתך עם מספריים.
   5. יש לנתח שטח גדול של עור העכבר הגבי (כ-1.5X4 ס"מ).
   6. יש לשטח את העור, בצד הדרמיס כלפי מטה, על נייר פילטר ולשים לב לכיוון הקדמי-אחורי של הדגימה.
   7. חתכו נייר סינון סביב העור המנותח, והניחו בשפופרת של 15 מ"ל מלאה בתמיסת פרפורמלדהיד (PFA) טרייה שהוכנה לאחרונה ב-PBS.
   8. תקן במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר, או לילה במקרר ב 4 ° C.
   9. לשטוף את העור 2x 5 דקות PBS בצינור 15 מ"ל.
      הערה: השלבים הבאים (1.1.10 - 1.1.12) הם צעדים אופציונליים לאחסון ארוך טווח של רקמות.
   10. יש לייבש עור מנותח ב-PBS עם ריכוז מוגבר של אתנול (25%, 50%, 70%) בצינור של 15 מ"ל במהלך שלבי שטיפה של שעה אחת בטמפרטורת החדר.
   11. יש לאחסן עור מיובש באתנול 70% ב-PBS בצינור של 15 מ"ל בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.
   12. ארבע שעות לפני הפינוי, יש להחזיר לחות לרקמת העור ב-PBS עם ריכוז יורד של אתנול (70%, 50%, 25%, 0%) בצינור של 15 מ"ל במהלך שלבי שטיפה של שעה אחת בטמפרטורת החדר.
2. ניקוי ביופסיות עור עכבר
   1. הכינו את תמיסת הניקוי CUBIC1 על ידי המסת 3.85 גרם אוריאה ו-3.85 גרם N,N,N',N',N'-TETRAKIS (2-hydroxypropyl) ethylenediamine במים מזוקקים של 5.38 מ"ל על תנור חימום המכוון ל-60-70°C. יש להשתמש במערבל חם.
   2. הוסף 2.31 גרם פוליאתילן גליקול מונו-p-איזוקטיל פניל אתר/טריטון X-100 לתמיסה ברגע שהיא צלולה והתקררה לטמפרטורת החדר.
   3. חתכו את עור העכבר עם סכין גילוח חד לביופסיות בממדים משוערים 0.2 x 0.5 ס"מ, ושקעו ב 5 מ"ל של תמיסת ניקוי CUBIC1 בצינור 15 מ"ל. כדי לייעל את ההדמיה של זקיקי השיער, ודא שהצד הארוך יותר של הביופסיה נחתך לאורך הכיוון האנטרו-אחורי של הדגימה.
   4. מניחים על מצע מסתובב בתנור הכלאה ב 37 מעלות צלזיוס.
   5. שנה את פתרון הסליקה לאחר 7 ימים. הכינו תמיסת CUBIC1 טרייה לפני השימוש.
   6. בדוק את שקיפות הרקמה לאחר 7 ימים. במידת הצורך, השאירו את הביופסיות בתמיסת ניקוי CUBIC1 עד שהרקמה תהיה שקופה לחלוטין.
   7. לאחר שהביופסיה של העור שקופה, הסר את תמיסת CUBIC1, והוסף 4 מ"ל של 1x PBS כדי לשטוף את הרקמה 4 פעמים במשך 6 שעות ב 37 ° C.
   8. יש לשטוף את רקמת העור ב-20% סוכרוז ב-PBS בצינור של 15 מ"ל למשך 4 שעות בטמפרטורה של 37°C.
   9. יש להקפיא את הרקמה בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) בצינור של 15 מ"ל למשך הלילה במקפיא של -80°C.
      הערה: שלב זה יגדיל את חדירות הביופסיה לחדירת נוגדנים בשלבים הבאים.

2. צביעת אימונופלואורסנציה

1. הפשירו את הרקמה משלב 1.2.9 לטמפרטורת החדר למשך 2-3 שעות.
2. שטפו את הרקמה בצינור של 15 מ"ל עם 5 מ"ל PBS למשך 8 שעות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את תרכובת OCT.
3. מעבירים את הביופסיות לצינור של 2 מ"ל, ודוגרים על רקמה בנוגדן 1 מ"ל של ארנב נגד קרטין14 או נוגדן ארנב נגד Ki67, שניהם מדוללים ביחס של 1:100 ב-PBST (PBS + 0.1% Triton-X100) למשך 3 ימים על שייקר בתנור של 37°C.
4. מעבירים את הביופסיות לצינור של 15 מ"ל, ושוטפים את הרקמה 4 פעמים במשך 6 שעות ב-5 מ"ל PBST על שייקר בתנור של 37°C.
5. מעבירים את הביופסיות לצינור 2 מ"ל, מוסיפים נוגדן משני 1 מ"ל נגד ארנב Alexa594 מדולל 1:100 ב-PBST ודגרים 3 ימים על שייקר בתנור 37°C.
6. מעבירים את הביופסיות לצינור של 15 מ"ל, ושוטפים את הרקמה 4 פעמים במשך 6 שעות ב-5 מ"ל PBST על שייקר בתנור של 37°C.
7. מעבירים את הביופסיות לצינור של 2 מ"ל, מוסיפים 1 מ"ל 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) תמיסת נגד גרעינית (1:1,000) ב-PBST ודגרים לילה על שייקר בתנור של 37°C.
8. הסר תמיסת צביעה נגדית DAPI, והוסף 1 מ"ל PBST לצינור 2 מ"ל כדי לשטוף רקמות 4 פעמים במשך 6 שעות על שייקר בתנור 37°C.
   הערה: שלב אופציונלי: ניתן לאחסן ביופסיות בחושך ב-1x PBS עם 0.02% נתרן אזיד למשך 3 שבועות לפחות.

3. הדמיה

1. הכינו את תמיסת הניקוי CUBIC2, המכילה 50% (w/v) סוכרוז, 25% (w/v) אוריאה, 10% (w/v) 2,2′,2′'-nitrilotriethanol, ו-0.1% (v/v) Triton X-100.
2. יש לדגור על רקמת העור בתמיסת 1 מ"ל CUBIC2 בצינור של 2 מ"ל על שייקר למשך 24 שעות בתנור של 37°C. שלב זה יהיה אפילו את מדד השבירה של הרקמה.
3. בדוק את בהירות הרקמה. ברגע שהוא ברור, מקם את ביופסיית העור כולה (0.2 x 0.5 ס"מ) על צדה הארוך יותר על כיסוי זכוכית, כך שכיוון אורך זקיקי השערה מקביל למשטח הכיסוי (#1 24 x 60 מ"מ).
   הערה: שלב אופציונלי: ניתן לאחסן ביופסיות מוכתמות בנוגדנים בתמיסת CUBIC2 למשך כ-7 ימים. ביופסיות מוכתמות באדום הנילוס ניתן לאחסן בתמיסת CUBIC2 רק עד יום אחד, ויש לצלם אותן בהקדם האפשרי.
4. הכינו תא הדמיה (איור 1).
   הערה: החומרים המתכלים הדרושים להכנת תא ההדמיה הם: דבק כחול, בצק משחק או דומה, ו-2 כיסויים (24 x 50 מ"מ) (איור 1A).
   1. הכינו שתי רצועות דקות של דבק כחול (קוטר של כ-1 מ"מ x 2 ס"מ), ושתי רצועות כיסוי (איור 1B).
   2. הניחו רצועות כחולות על חלקת כיסוי אחת, כדי לאפשר מספיק מקום לביופסיה של העור (איור 1C, שלב 3.4.3).
   3. הניחו ביופסיית עור בין רצועות על הכיסוי בטיפת תמיסת CUBIC2 (איור 1C).
   4. כסו את ביופסיית העור בכיסוי השני (איור 1D).
5. הניחו את תא ההדמיה עם ביופסיית העור המותקנת על במת מיקרוסקופ קונפוקלי והזיזו את הרקמה למסלול האור.
6. סרוק את הדגימה באמצעות מקור אור כספית או הלוגן ומסנני אפיפלואורסצנטיות סטנדרטיים (לדוגמה, DAPI/GFP/CY3/CY5) כדי לזהות אזורי עניין מוכתמים פלואורסצנטית.
7. אזורי עניין בתמונה באמצעות מטרה של 10X ו-20X (NA 0.75) וטכניקות הדמיה פלואורסצנטיות קונפוקליות סטנדרטיות (למשל, עם דגימות מוכתמות של DAPI מוארות בלייזר של 405 ננומטר ואוספות אות פלואורסצנטי בין 425-475 ננומטר, ועם אלקסה פלואור 594 או אדום הנילוס דגימות מוכתמות מוארות בלייזר של 561 ננומטר ואוספות אות פלואורסצנטי בין 570-620 ננומטר).
8. צור ערימות תמונה Z של כל אזור עניין באמצעות תוכנת מיקרוסקופ Z-stack לרכישת תמונות (למשל, באמצעות תוכנת הדמיית אלמנטים NIS 4.13 כמתואר להלן).
   1. ודא עוצמת לייזר אופטימלית ובחר הגדרות PMT HV/Offset כדי לאסוף פלואורסצנטיות דגימה.
   2. פתח את סרגל הכלים "ND Acquisition" מתוך "Acquisition Controls".
   3. בחר בכרטיסייה "הגדרת סדרה Z" (ודא שכל הכרטיסיות האחרות לא נבחרו).
   4. בזמן סריקה חיה, התמקדו בחלק העליון של הדגימה ולחצו על כפתור "למעלה".
   5. התמקדו בתחתית הדגימה ולחצו על כפתור "למטה".
   6. הזן את גודל הצעד הנדרש (או לחץ על לחצן גודל צעד ממוטב).
   7. לחץ על כפתור "הפעל עכשיו".
   8. שמרו אוספי Z שנוצרו כתוצאה מכך כאוספי תמונות Tiff נפרדים (פלואורוכרום אחד לכל אוסף Z לתמונה).
9. השתמש בערימות Z של תמונות כדי לשחזר אזורי נפח תלת-ממדיים בעלי עניין באמצעות תוכנת ניתוח תלת-ממדית (לדוגמה, באמצעות Imaris x64 7.2.3 כמתואר להלן).
   1. הפעל תוכנת ניתוח.
   2. בחר את כפתור "עקף" בסרגל הכלים ליצירת אמצעי אחסון תלת מימדי.
   3. פתח תמונה בצבע ראשון מסוג Z-stack (לדוגמה, DAPI).
   4. השתמש בכלי 'הוסף ערוץ' כדי להוסיף ערוצי צבע נוספים, ערוץ אחד לכל פלואורוכרום. לפיכך, מדגם המכיל הן DAPI והן Alexa Fluor 594 fluorochromes ידרוש שני ערוצים.
   5. השתמש בכלי "מאפייני תמונה" כדי להגדיר את מידות הפיקסלים (ווקסל) הנכונות (XYZ), כפי שנקבע בסעיף 3.7 לעיל.
   6. השתמש בכלי "התאמת תצוגה" כדי לשנות את צבעי הערוצים לפי הצורך (לדוגמה, הגדר ערוץ DAPI לכחול, ערוץ Alexa Fluor 594 לאדום).
   7. כדי למקם את אמצעי האחסון התלת-ממדי בחלון התמונה, השתמש בעכבר המחשב כדי ללחוץ ולגרור עוצמת קול כנדרש.
   8. השתמש בכלי "תמונה" בסרגל הכלים כדי ליצור צילומי מסך של תמונת התלת-ממד.
   9. השתמש בכלי "הנפשה" בסרגל הכלים כדי ליצור סרטים של סיבוב דגימה תלת מימדי.

איור 1: הכנת תא ההדמיה. ת: החומרים המתכלים הדרושים להכנת תא ההדמיה הם דבק כחול, בצק משחק או דומה, ו -2 כיסויים (24 x 50 מ"מ). B: מכינים שתי רצועות דקות של דבק כחול (קוטר כ-2X2 ס"מ), ושתי רצועות כיסוי. C: הניחו רצועות כחולות על כיסוי אחד, כדי לאפשר מספיק מקום לביופסיה של העור. מניחים את ביופסיית העור בטיפת תמיסת CUBIC2 בין שתי הרצועות. D: מניחים את הכיסוי השני על רצועות כחולות כדי לכסות את הביופסיה של העור.