כל ההליכים המערבים בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת רקמת העור של העכבר השקוף
הערה: כל העכברים ששימשו במחקר זה היו על רקע גנטי C57BL/6
- אוסף רקמת עור עכבר.
- המתת חסד אנושית של העכברים על ידי פריקת צוואר הרחם.
- יש להסיר בזהירות שערות מאזור העור הרלוונטי בעזרת גוזם המקפיד שלא לפצוע את העור.
- יש לשטוף את העור כדי לטהר עם 70% אתנול במי מלח חוצצים פוספט (PBS).
- להרים את עור הצוואר הגבי עם מלקחיים ולעשות חתך עם מספריים.
- יש לנתח שטח גדול של עור העכבר הגבי (כ-1.5X4 ס"מ).
- יש לשטח את העור, בצד הדרמיס כלפי מטה, על נייר פילטר ולשים לב לכיוון הקדמי-אחורי של הדגימה.
- חתכו נייר סינון סביב העור המנותח, והניחו בשפופרת של 15 מ"ל מלאה בתמיסת פרפורמלדהיד (PFA) טרייה שהוכנה לאחרונה ב-PBS.
- תקן במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר, או לילה במקרר ב 4 ° C.
- לשטוף את העור 2x 5 דקות PBS בצינור 15 מ"ל.
הערה: השלבים הבאים (1.1.10 - 1.1.12) הם צעדים אופציונליים לאחסון ארוך טווח של רקמות.
- יש לייבש עור מנותח ב-PBS עם ריכוז מוגבר של אתנול (25%, 50%, 70%) בצינור של 15 מ"ל במהלך שלבי שטיפה של שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- יש לאחסן עור מיובש באתנול 70% ב-PBS בצינור של 15 מ"ל בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.
- ארבע שעות לפני הפינוי, יש להחזיר לחות לרקמת העור ב-PBS עם ריכוז יורד של אתנול (70%, 50%, 25%, 0%) בצינור של 15 מ"ל במהלך שלבי שטיפה של שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- ניקוי ביופסיות עור עכבר
- הכינו את תמיסת הניקוי CUBIC1 על ידי המסת 3.85 גרם אוריאה ו-3.85 גרם N,N,N',N',N'-TETRAKIS (2-hydroxypropyl) ethylenediamine במים מזוקקים של 5.38 מ"ל על תנור חימום המכוון ל-60-70°C. יש להשתמש במערבל חם.
- הוסף 2.31 גרם פוליאתילן גליקול מונו-p-איזוקטיל פניל אתר/טריטון X-100 לתמיסה ברגע שהיא צלולה והתקררה לטמפרטורת החדר.
- חתכו את עור העכבר עם סכין גילוח חד לביופסיות בממדים משוערים 0.2 x 0.5 ס"מ, ושקעו ב 5 מ"ל של תמיסת ניקוי CUBIC1 בצינור 15 מ"ל. כדי לייעל את ההדמיה של זקיקי השיער, ודא שהצד הארוך יותר של הביופסיה נחתך לאורך הכיוון האנטרו-אחורי של הדגימה.
- מניחים על מצע מסתובב בתנור הכלאה ב 37 מעלות צלזיוס.
- שנה את פתרון הסליקה לאחר 7 ימים. הכינו תמיסת CUBIC1 טרייה לפני השימוש.
- בדוק את שקיפות הרקמה לאחר 7 ימים. במידת הצורך, השאירו את הביופסיות בתמיסת ניקוי CUBIC1 עד שהרקמה תהיה שקופה לחלוטין.
- לאחר שהביופסיה של העור שקופה, הסר את תמיסת CUBIC1, והוסף 4 מ"ל של 1x PBS כדי לשטוף את הרקמה 4 פעמים במשך 6 שעות ב 37 ° C.
- יש לשטוף את רקמת העור ב-20% סוכרוז ב-PBS בצינור של 15 מ"ל למשך 4 שעות בטמפרטורה של 37°C.
- יש להקפיא את הרקמה בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) בצינור של 15 מ"ל למשך הלילה במקפיא של -80°C.
הערה: שלב זה יגדיל את חדירות הביופסיה לחדירת נוגדנים בשלבים הבאים.
2. צביעת אימונופלואורסנציה
- הפשירו את הרקמה משלב 1.2.9 לטמפרטורת החדר למשך 2-3 שעות.
- שטפו את הרקמה בצינור של 15 מ"ל עם 5 מ"ל PBS למשך 8 שעות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את תרכובת OCT.
- מעבירים את הביופסיות לצינור של 2 מ"ל, ודוגרים על רקמה בנוגדן 1 מ"ל של ארנב נגד קרטין14 או נוגדן ארנב נגד Ki67, שניהם מדוללים ביחס של 1:100 ב-PBST (PBS + 0.1% Triton-X100) למשך 3 ימים על שייקר בתנור של 37°C.
- מעבירים את הביופסיות לצינור של 15 מ"ל, ושוטפים את הרקמה 4 פעמים במשך 6 שעות ב-5 מ"ל PBST על שייקר בתנור של 37°C.
- מעבירים את הביופסיות לצינור 2 מ"ל, מוסיפים נוגדן משני 1 מ"ל נגד ארנב Alexa594 מדולל 1:100 ב-PBST ודגרים 3 ימים על שייקר בתנור 37°C.
- מעבירים את הביופסיות לצינור של 15 מ"ל, ושוטפים את הרקמה 4 פעמים במשך 6 שעות ב-5 מ"ל PBST על שייקר בתנור של 37°C.
- מעבירים את הביופסיות לצינור של 2 מ"ל, מוסיפים 1 מ"ל 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) תמיסת נגד גרעינית (1:1,000) ב-PBST ודגרים לילה על שייקר בתנור של 37°C.
- הסר תמיסת צביעה נגדית DAPI, והוסף 1 מ"ל PBST לצינור 2 מ"ל כדי לשטוף רקמות 4 פעמים במשך 6 שעות על שייקר בתנור 37°C.
הערה: שלב אופציונלי: ניתן לאחסן ביופסיות בחושך ב-1x PBS עם 0.02% נתרן אזיד למשך 3 שבועות לפחות.
3. הדמיה
- הכינו את תמיסת הניקוי CUBIC2, המכילה 50% (w/v) סוכרוז, 25% (w/v) אוריאה, 10% (w/v) 2,2′,2′'-nitrilotriethanol, ו-0.1% (v/v) Triton X-100.
- יש לדגור על רקמת העור בתמיסת 1 מ"ל CUBIC2 בצינור של 2 מ"ל על שייקר למשך 24 שעות בתנור של 37°C. שלב זה יהיה אפילו את מדד השבירה של הרקמה.
- בדוק את בהירות הרקמה. ברגע שהוא ברור, מקם את ביופסיית העור כולה (0.2 x 0.5 ס"מ) על צדה הארוך יותר על כיסוי זכוכית, כך שכיוון אורך זקיקי השערה מקביל למשטח הכיסוי (#1 24 x 60 מ"מ).
הערה: שלב אופציונלי: ניתן לאחסן ביופסיות מוכתמות בנוגדנים בתמיסת CUBIC2 למשך כ-7 ימים. ביופסיות מוכתמות באדום הנילוס ניתן לאחסן בתמיסת CUBIC2 רק עד יום אחד, ויש לצלם אותן בהקדם האפשרי.
- הכינו תא הדמיה (איור 1).
הערה: החומרים המתכלים הדרושים להכנת תא ההדמיה הם: דבק כחול, בצק משחק או דומה, ו-2 כיסויים (24 x 50 מ"מ) (איור 1A).
- הכינו שתי רצועות דקות של דבק כחול (קוטר של כ-1 מ"מ x 2 ס"מ), ושתי רצועות כיסוי (איור 1B).
- הניחו רצועות כחולות על חלקת כיסוי אחת, כדי לאפשר מספיק מקום לביופסיה של העור (איור 1C, שלב 3.4.3).
- הניחו ביופסיית עור בין רצועות על הכיסוי בטיפת תמיסת CUBIC2 (איור 1C).
- כסו את ביופסיית העור בכיסוי השני (איור 1D).
- הניחו את תא ההדמיה עם ביופסיית העור המותקנת על במת מיקרוסקופ קונפוקלי והזיזו את הרקמה למסלול האור.
- סרוק את הדגימה באמצעות מקור אור כספית או הלוגן ומסנני אפיפלואורסצנטיות סטנדרטיים (לדוגמה, DAPI/GFP/CY3/CY5) כדי לזהות אזורי עניין מוכתמים פלואורסצנטית.
- אזורי עניין בתמונה באמצעות מטרה של 10X ו-20X (NA 0.75) וטכניקות הדמיה פלואורסצנטיות קונפוקליות סטנדרטיות (למשל, עם דגימות מוכתמות של DAPI מוארות בלייזר של 405 ננומטר ואוספות אות פלואורסצנטי בין 425-475 ננומטר, ועם אלקסה פלואור 594 או אדום הנילוס דגימות מוכתמות מוארות בלייזר של 561 ננומטר ואוספות אות פלואורסצנטי בין 570-620 ננומטר).
- צור ערימות תמונה Z של כל אזור עניין באמצעות תוכנת מיקרוסקופ Z-stack לרכישת תמונות (למשל, באמצעות תוכנת הדמיית אלמנטים NIS 4.13 כמתואר להלן).
- ודא עוצמת לייזר אופטימלית ובחר הגדרות PMT HV/Offset כדי לאסוף פלואורסצנטיות דגימה.
- פתח את סרגל הכלים "ND Acquisition" מתוך "Acquisition Controls".
- בחר בכרטיסייה "הגדרת סדרה Z" (ודא שכל הכרטיסיות האחרות לא נבחרו).
- בזמן סריקה חיה, התמקדו בחלק העליון של הדגימה ולחצו על כפתור "למעלה".
- התמקדו בתחתית הדגימה ולחצו על כפתור "למטה".
- הזן את גודל הצעד הנדרש (או לחץ על לחצן גודל צעד ממוטב).
- לחץ על כפתור "הפעל עכשיו".
- שמרו אוספי Z שנוצרו כתוצאה מכך כאוספי תמונות Tiff נפרדים (פלואורוכרום אחד לכל אוסף Z לתמונה).
- השתמש בערימות Z של תמונות כדי לשחזר אזורי נפח תלת-ממדיים בעלי עניין באמצעות תוכנת ניתוח תלת-ממדית (לדוגמה, באמצעות Imaris x64 7.2.3 כמתואר להלן).
- הפעל תוכנת ניתוח.
- בחר את כפתור "עקף" בסרגל הכלים ליצירת אמצעי אחסון תלת מימדי.
- פתח תמונה בצבע ראשון מסוג Z-stack (לדוגמה, DAPI).
- השתמש בכלי 'הוסף ערוץ' כדי להוסיף ערוצי צבע נוספים, ערוץ אחד לכל פלואורוכרום. לפיכך, מדגם המכיל הן DAPI והן Alexa Fluor 594 fluorochromes ידרוש שני ערוצים.
- השתמש בכלי "מאפייני תמונה" כדי להגדיר את מידות הפיקסלים (ווקסל) הנכונות (XYZ), כפי שנקבע בסעיף 3.7 לעיל.
- השתמש בכלי "התאמת תצוגה" כדי לשנות את צבעי הערוצים לפי הצורך (לדוגמה, הגדר ערוץ DAPI לכחול, ערוץ Alexa Fluor 594 לאדום).
- כדי למקם את אמצעי האחסון התלת-ממדי בחלון התמונה, השתמש בעכבר המחשב כדי ללחוץ ולגרור עוצמת קול כנדרש.
- השתמש בכלי "תמונה" בסרגל הכלים כדי ליצור צילומי מסך של תמונת התלת-ממד.
- השתמש בכלי "הנפשה" בסרגל הכלים כדי ליצור סרטים של סיבוב דגימה תלת מימדי.
