$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.
1. שינוי גנטי של קרטינוציטים אנושיים ראשוניים
הערה: השתמש בתאי עוף חול אמפוטרופיים הגדלים במדיית DMEM מלאה [DMEM + סרום בקר עוברי 10% (FBS) + עט/סטרפטוקו] כדי לייצר וירוסים להדביק קרטינוציטים אנושיים ראשוניים. גני אריזה נגיפיים המקודדים חלבונים כגון gag-pol ו- envelope משולבים ביציבות בגנום תא הפניקס, המאפשר ייצור וירוסים כאשר הם נגועים בווקטור רטרו-ויראלי. תאי פיניקס יכולים להיות נגועים ביעילות גבוהה המאפשרת ייצור טיטר נגיפי גבוה. וירוסים המיוצרים מקו אריזה זה יכולים גם להדביק מגוון רחב של תאי יונקים, כולל בני אדם.
- יום 1: יום לפני ההדבקה, זרעו תאי עוף החול בצלחת בת 6 בארות בצפיפות של 800,000 תאים לבאר במדיית DMEM מלאה.
- יום 2: יום הטרנספקציה, השתמש 3 מיקרוגרם של וקטורים רטרו-ויראליים לכל באר. Aliquot 3 מיקרוגרם של וקטור רטרו-ויראלי לתוך צינור 1.5 מ"ל. השתמש בתערובת של 100 μL DMEM בתוספת 6 μL של מגיב transfection עבור כל 3 מיקרוגרם של וקטור. מערבבים 6 μL של מגיב transfection עם 100 μL DMEM בצינור 1.5 מ"ל. (הווקטורים הרטרו-ויראליים שבהם נעשה שימוש מפורטים בטבלת הציוד/חומרים)
- דוגרים במשך 5 דקות ומוסיפים את תערובת 106 μL לתוך הצינור pre-aliquoted המכיל 3 מיקרוגרם של וקטור רטרוויראלי. מערבבים ודגרים ב-RT במשך 30 דקות. מוסיפים את כל התערובת הזו טיפה לכל באר של תאי עוף החול.
- יום 3: יום לאחר הטרנספקציה, הסר את המדיה מתאי עוף החול והוסף 2 מ"ל של מדיה DMEM מלאה טרייה. באותו יום, זרעו קרטינוציטים אנושיים ראשוניים לתוך צלחות של 6 בארות בצפיפות של 75,000 תאים לבאר. שמור על הקרטינוציטים בתווך ללא קרטינוציטים בסרום (KCSFM) עם אנטיביוטיקה (pen/strep).
הערה: קרטינוציטים אנושיים ראשוניים נרכשו. ניתן לרכוש תאים ממגוון ספקים (המפורטים בטבלת החומרים).
- יום 4: קצרו את המדיה מתאי עוף החול הנגועים, המכילים כעת חלקיקים נגיפיים. מעבירים את המדיה דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר באמצעות מזרק (כדי להסיר תאי עוף חול מזהמים) ומניחים 2 מ"ל על הקרטינוציטים (מצופים ב-75,000 תאים/באר ביום הקודם). הוסף הקסדימתרין ברומיד (5 מיקרוגרם/מ"ל) למדיה כדי לסייע בתיווך תהליך הזיהום. טיטרים ויראליים הם ~ 1 x 107 TU / מ"ל.
- סובבו את לוחות 6 הקידוחים בצנטריפוגה במהירות של 200 x גרם למשך שעה אחת ב-RT. לאחר הסיבוב, הסר את המדיה המכילה וירוס ושטוף את התאים פעם אחת עם PBS 1x לפני הוספת KCSFM.
- יום 5: להדביק שוב את אותה אצווה של קרטינוציטים כמו ב-1.4, באמצעות 2 מ"ל של מדיה מסוננת המכילה הקסדימתרין ברומיד (5 מיקרוגרם/מ"ל). סובב אותו ב 200 x גרם במשך שעה אחת ב- RT כדי להסיר מדיה המכילה וירוס ולשטוף עם 1x PBS ולאחר מכן להוסיף KCSFM.
הערה: בחר את הקרטינוציטים באמצעות תרופה אם יש סמן לבחירה על הווקטור הרטרו-ויראלי והרחב לשימוש בניתוח במורד הזרם או ביישומים כגון תרביות אורגנוטיפיות.