כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. קציר וזריעה ראשוניים של קרטינוציטים
- יש להרדים ארבע עד חמש נקבות עכברים בוגרות באמצעות שאיפתCO2 בהתאם לתקנים מאושרים של מתקן בעלי חיים/IACUC. עם זאת, פרוטוקול זה עשוי לשמש גם עבור עכברים נקבות/זכרים בודדים.
- קוצצים כ-9 ס"מ2 מהפרווה הגבית בעזרת קוצץ חשמלי של בעלי חיים ומכניסים את כל העכברים החתוכים לצנצנת של 500 מ"ל עם מספיק תמיסת חיטוי פובידון-יוד (לא לשפשף) כדי לכסות אותם למשך 1-2 דקות. נערו היטב את הצנצנת כדי לצפות את תמיסת החיטוי מעל העכברים באופן שווה.
- יוצקים את התמיסה ושוטפים במים נקיים עד שהנוזל מתבהר. חזור על אותה שטיפה אנטיספטית ואחריה שטיפה במים. לאחר השטיפה האנטיספטית בתמיסת יוד, השרו את כל העכברים באתנול 70% למשך 5-10 דקות.
הערה: עכברים עם פרווה בהירה (למשל, BALB/c) ישמרו על צבע צהבהב קל משטיפות היוד המחטאות, בעוד שעכברים כהים יותר (למשל, C57BL/6) לא ישמרו על כך. יש לציין כי כדאיות התאים או צמיחת התרבית אינם מושפעים בשל הצבע הצהוב.
- הסר בזהירות את העור הגבי החתוך באמצעות מלקחיים ומספריים במכסה מנוע זרימה למינרית. הניחו את העור הגבי הנכרת בצינור חרוטי מלא PBS/2x gentamycin. הימנע משימוש בעור צד הגחון כדי למנוע זיהום תאי חלב בתרבית.
- בעזרת מלקחיים ואזמל, הניחו עור גבי אחד בכל פעם שעיר על צלחת פטרי דקה. התחילו לגרד את כל הרקמה התת עורית, כולל שומן מהצד הגחוני של רקמת העור, עד שהיא שקופה למחצה. נסו להסיר מקסימום עקבות של רקמה תת עורית מבלי לקרוע את העור (חלק זקיק השיער). כמו כן, אין לגרד במשך זמן רב ולהימנע מייבוש העור.
- יש לשמור עור מרוטש בתמיסת PBS עד שכל שאר העורות הנותרים יעובדו. לאחר מכן, בעזרת אזמל, פורסים את הקליפות לרצועות בגודל 0.5X1-1.5 ס"מ ומניחים את הצד השעיר על צלחת פטרי סטרילית.
- בזהירות פיפטה 20 מ"ל של PBS/2x תמיסת Gentamicin מעורבב עם טריפסין (0.25%) לתוך צלחת פטרי פלסטיק 100 מ"מ x 20 מ"מ. באמצעות מלקחיים סטריליים, להעביר את העורות ולהציף אותם בצד שעיר על פני השטח של תמיסת טריפסין במשך 2 שעות באינקובטור 32 °C.
הערה: זמן וטמפרטורה של טריפסיניזציה חיוניים לתפוקה טובה של קרטינוציטים ראשוניים בעלי יכולת גידול גבוהה. למרות ששיטות אחרות עשויות לספק יבולים טובים של תאים בני קיימא, יכולת ההתרבות של הקרטינוציטים הייתה פחות משביעת רצון.
- במהלך זמן דגירה זה של שעתיים, צפו צלחות בציפוי קולגן והניחו אותן בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת (ראו שלב 1.1.2). עבור בדיקות קלונוגניות, צלחות פטרי 60 מ"מ מצופות 24 שעות לפני קציר קרטינוציטים כדי לאפשר לשכבת מזין 3T3 המוקרן להיצמד לתחתית ולהתפשט באופן שווה.
הערה: ציפוי צלחות תרבית לתרבית קלונוגנית חשוב מאוד להתקשרות נכונה, היווצרות מושבות וגדילה/התפשטות סופית של קרטינוציטים אפידרמיסים של עכברים.
- שלב גירוד האפידרמיס: סדרו צלחת פטרי מרובעת מפלסטיק סטרילית וצרו משטח בשיפוע של 30 מעלות לגירוד אפידרמיס תקין עם 15 מ"ל של מדיום קציר (ראו טבלה 1). בזהירות להסיר רצועת עור צפה מתמיסת טריפסין עם מלקחיים מעוקלים. לאחר מכן, עם להב אזמל חדש, לגרד את האפידרמיס ואת השערות לתוך המדיום.
- אין להשתמש בכוח מופרז, אלא להשתמש בכוח מספיק כדי לגרד את האפידרמיס או להשפיע על יכולת הקיום של התא.
- במהלך גירוד האפידרמיס, יש לשמור על הלהב בניצב לחתיכת העור. אם הלהב מכוון בזווית לכיוון תנועת הלהב, יש יותר סיכוי לקרע בעור. אם הלהב נמצא בזווית הרחק מתנועת הלהב, יש סיכוי גדול יותר להסרת אפידרמיס חלקית.
- מוזגים בזהירות את מצע הקציר המכיל תאי אפידרמיס משופשפים לתוך צנצנת סטרילית של 60 מ"ל (ניתנת להרכבה ולשימוש חוזר) עם מוט ערבוב מגנטי בגודל 1.5 אינץ'. שטפו את צלחת הפטרי עם אמצעי קציר נוסף כדי לאסוף את תאי האפידרמיס הנותרים ולהביא את הנפח הסופי ל -30 מ"ל. השתמשו במערבל מגנטי וערבבו ב-100 סל"ד במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. תהליך זה יסיר את תאי האפידרמיס הכלואים משערות.
- מניחים מסננת תאים סטרילית של 70 מיקרומטר על גבי צינור חרוטי של 50 מ"ל. מסננת התא מתאימה על גבי צינור חרוטי של 50 מ"ל.
- קח את הצנצנת לתוך מכסה מנוע בטיחות ביולוגית. מוציאים את מוט הערבוב ויוצקים את תכולתו למסנן המסננת המחובר לצינור חרוטי בנפח 50 מ"ל. מסננים שיער לא רצוי ויריעות של שכבת הקרנית.
- לחץ על השערות יחד עם חומרי שכבת הקרנית בתוך המסננת ותפעל אותם כדי לשחרר את תאי השערה הכלואים. השתמש 5 מ"ל של אמצעי הקציר כדי לאפשר לתאים הלכודים הנותרים להשתחרר ולזרום לתוך הצינור. הביאו את הנפח הכולל עד 50 מ"ל בצינור חרוט.
- מכסים את הצינור החרוטי 50 מ"ל עם תסנין תאים וצנטריפוגה ב 160 x גרם למשך 7 דקות ב 4 ° C. לאחר מכן, שואפים את supernatant ולהוסיף 5 מ"ל של בינוני הקציר. לבסוף, להשעות מחדש את גלולת התא על ידי triturating בעדינות ~ 20x עם פיפט 5 מ"ל.
- בשלב זה, שמור את התאים בארגז קרח כדי למנוע צבירה. לאחר מכן, להוסיף 25 מ"ל של בינוני הקציר triturate שוב (20-25x).
- כדי להבטיח ספירת קרטינוציטים מדויקת בשלב זה, קח 1 מ"ל של תרחיף תאים והוסף 19 מ"ל אמצעי קציר. כעת, דילול התא הוא 1:20 בצינור חרוטי של 50 מ"ל. אם קרטינוציטים נקצרים מעכבר יחיד, התאם את עוצמת ההשעיה של התא. לדוגמה, במקום 30 מ"ל, השתמש ב- 15 מ"ל ובצע דילול של 1:10 לספירת התאים.
- Pipet 0.5 מ"ל של תאים מדוללים מן הצינור החרוטי 50 מ"ל (דילול 1:20) ולהעביר צינור microcentrifuge autoclaved 1.5 מ"ל. הסר 0.2 מ"ל (200 מיקרוליטר) של תערובת תאים לצינור מיקרוצנטריפוגה אחר של 1.5 מ"ל והוסף נפח שווה (200 מיקרוליטר) של תמיסת טריפאן כחולה 0.4%. מערבבים בעדינות תמיסה זו 3x ומעבירים תאים להמוציטומטר לספירת קרטינוציטים גרעיניים.
- ציון כל התאים הכחולים הכהים חיוביים לכחול טריפאן כתאים מתים שאינם ברי קיימא, וציון תאים קטנים זהובים ורדרדים כתאים בני קיימא. לפיכך, התשואה הסופית של קרטינוציטים לעכבר צריכה להיות סביב 30 מיליון תאים בני קיימא.
- צנטריפוגה את הצינור החרוטי המקורי של 50 מ"ל (משלב 1.8) למשך 7 דקות ב 160 x גרם ב 4 ° C. בשלב זה, להשהות מחדש את התאים בתווך הרצוי ולבצע את הדילול הנדרש עבור תאים זורעים.
- עבור תרבית המונית, זרע 2 עד 4 מיליון תאי זהב קיימא בכל צלחת פטרי 35 מ"מ בתווך תרבית תאים (מדיום מסוג KGM + תוספי מזון לתרביות חד-שכבתיות) (ראה טבלה 1). לבדיקה קלונוגנית (היווצרות מושבה), זרעו 1,000 תאים לכל צלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ על שכבות הזנה 3T3 של עכבר שוויצרי המוקרן בקרני רנטגן עם ציפוי קולגן ומדיום E שונה של Willia's עם תוספים וסרום.
- השתמש בסך הכל 2 עד 4 מ"ל בינוני עבור 35 מ"מ ו 60 מ"מ צלחות פטרי, בהתאמה. כמו כן, פורמולציה DMEM ו Williams E בינוני שנרכשו ATCC עם רמות מופחתות של סודיום ביקרבונט לשימוש ב 5% CO2.
- לגדל את תאי התרבית (מסה או קלונוגני) ב 32 ° C, 95% לחות עם 5% CO2. שנה את המדיה יום אחד לאחר הזריעה הראשונית לתרבות המונים, ולאחר מכן 3 פעמים בשבוע לאחר מכן. עם זאת, עבור בדיקות שיבוט, השינוי הבינוני הראשון הוא יומיים לאחר זריעת תאים ו -3 פעמים בשבוע לאחר מכן.
- עבור תרבית שבטים, לטפח תאים במרווחים של שבועיים וארבעה שבועות. לאחר השלמת תרביות השבט (2 או 4 שבועות), שואפים את המדיום. תקנו את המושבות ב-10% פורמלין חוצץ למשך הלילה בטמפרטורת החדר והכתימו עם 0.5% רודמין B במי אוטוקלאבה למשך שעה אחת. לאחר מכן, להסיר את כתם רודמין B עם פיפטה מקצה הכלים.
- שוטפים את הכלים במים קרים עד שהכלים צלולים. מניחים את הכלים נטויים על מכסה הכלים ומניחים להם להתייבש לספירת המושבה הסופית. יש לציין, בעת ביצוע בדיקת תרבית קלונוגנית, לעולם אין צינור <1 מ"ל של תאים. אם התאים מרוכזים, מדללים סדרתית את ריכוז התא.
| פתרונות ומדיה | הערות |
| פתרונות קציר | |
| 2.5% טריפסין (5 מ"ל) | |
| PBS של Dulbecco (500 מ"ל) | |
| גנטמיצין (2 מ"ל) | |
| PBS עם 2x gentamycin (45 מ"ל) | |
| מלח חוצץ פוספט (PBS) עם 2x gentamycin | |
| תמיסת טריפסין | |
| פתרונות לתרביות תאים | |
| תמיסת ציפוי כלים Purecol-fibronectin: | |
| 1 מטר HEPES (1 מ"ל) | |
| 116 mM CaCl2 (1 מ"ל) | |
| אלבומין בסרום בקר 1.0 מ"ג/מ"ל (10 מ"ל) | |
| מדיום תרבית תאים (100 מ"ל) | |
| פיברונקטין (1 מ"ג) | |
| קולגן Purecol (1 מ"ל) | |
| תמיסת הקפאת תאים | |
| DMSO (2 מ"ל) | |
| DMEM עם 10% BCS ו-pen-strep | |
| אמצעי קציר | צריך להיות בלי סידן |
| 2x gentamycin (1 מ"ל) | |
| FBS (50 מ"ל) | |
| SMEM (500 מ"ל) | |
| E Media עתיר סידן ויליאמס עם: | |
| EGF (5 מיקרוגרם/מ"ל) 1 מ"ל | |
| גלוטמין 14.5 מ"ל | |
| הידרוקורטיזון (1 מ"ג/מ"ל) 0.5 מ"ל | |
| אינסולין 1 מ"ל | |
| LinoAcid-BSA (0.1 מ"ג/מ"ל) 0.5 מ"ל | |
| MEM Ess AminoAcids 4 מ"ל | |
| ויטמינים MEM 5 מ"ל | |
| פניצילין-סטרפטומיצין 5 מ"ל | |
| טרנספרין (5 מ"ג/מ"ל) 1 מ"ל | |
| ויטמין A (1 מ"ג/1,000 מיקרוליטר) 57.5 מיקרוליטר | |
| ויטמין E 1 מ"ג/מ"ל (4°C) 3.5 מיקרוליטר | |
| ויטמין D2 (10 מ"ג/מ"ל) 50 מיקרוליטר | |
| 3T3 פיברובלסט מדיום צמיחה מלא (CGM) | |
| BCS (100 מ"ל) | |
| DMEM (900 מ"ל) | |
| פניצילין-סטרפטומיצין (10 מ"ל) | |
| ק.ג.מ | מדיום המשמש לתרבית המונים הוא מדיום מופחת סידן |
| מוריס 2 בינוני עם אותם תוספים כמו וויליאמס E | גרסה מופחתת סידן של Williams E עם תוספי מזון |
טבלה 1: פתרון ומתכוני מדיה.
