transgenesis מבוסס וקטור miniCoopR: טכניקה לסינון גנים הגורמים למלנומה במודל הגידול של דגי זברה

כל ההליכים המערבים בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. בדיקות סקר למלנומה המתפרצת

1. צור שיבוטים של כניסה אמצעית של Gateway על ידי PCR, הגברת מסגרת הקריאה הפתוחה באורך מלא של גנים מעניינים (GOI) ושילוב מחדש לתוך pDONR 221 באמצעות BP clonase II (Invitrogen). השתמשו בטכנולוגיית Multisite Gateway (Invitrogen) כדי לשלב מחדש p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit #302 p3E_SV40polyA ו-miniCoopR כדי למקם גנים מעניינים תחת מקדם ה-mitfa בווקטור miniCoopR (איור 1A).
2. הזריקו 25 פיקוגרמות של כל שיבוט יחד עם 25 פיקוגרמות Tol2 transposase mRNA לתוך תא אחד Tg (mitfa:BRAFV600E); עמ' 53(LF); Mitfa(lf)עוברים משולשים הומוזיגוטיים של דגי זברה כפי שתואר קודם לכן. לדגור על העוברים המוזרקים ב 28.5 ° C. להסיר את כל העוברים המתים ב 24 hpf.
3. בחרו חיות טרנסגניות עם מלנוציטים שניצלו במהירות של 72 HPF על-ידי הנחת צלחת פטרי המכילה עוברים מוזרקים במיקרוסקופ מנתח תחת אור מקרי על רקע לבן (איור 1A).
4. העבר בעלי חיים למיכלי 3 ליטר במשתלה של מתקן דגי הזברה ב 4 dpf.
5. לאחר חודשיים, בחרו את החיות עם לפחות אזור אחד של הצלת מלנוציטים גדול מ-4 מ"מ² (איור 1A). קיים מתאם חזק בין מידת ההצלה של מלנוציטים בגיל 72 HPF לבין מידת ההצלה של מלנוציטים לאחר חודשיים. כאשר עוברים עם הצלת מלנוציטים נקטפים ב 72 hpf, רובם (~ 80%) יהיה לפחות אזור אחד של הצלת מלנוציטים גדול מ 4 מ"מ² לאחר חודשיים.
6. סקרו את החיות שנבחרו מדי שבוע לנוכחות גידולים (איור 1B). קיים מתאם חזק בין שינויים היסטופתולוגיים ומורפולוגיים. המעבר משפיר לממאיר מוכר כשינוי מורפולוגי כאשר נגעים מורמים מעל פני החיה. בידוד בעלי חיים נושאי גידול לצורך מחקר.
7. ציירו עקומות הישרדות ללא מלנומה עם הגיל בשבועות על האבסיסה ואחוז הישרדות ללא מלנומה על הקואורדינטה. חיות עם מלנוציטים שמבטאים גן מעניין מושוות לחיות ביקורת שמבטאות EGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר) במלנוציטים (איור 1C). חציון הופעת הגידול בבעלי חיים שהוזרקו להם מיני CoopR-EGFP הוא כ-18 שבועות. קבע אם שתי העקומות שונות סטטיסטית באמצעות בדיקת דירוג יומן.

איור 1. בדיקת משנים להופעת מלנומה באמצעות בדיקת miniCoopR. א) סכמטי של בדיקת miniCoopR. עובר עם מלנוציטים שניצלו (ראש חץ) המכיל את וקטור המיני-CoopR ואת הגן המעניין. סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר. מבוגר עם יותר מ 4 מ"מ2 חילוץ מלנוציטים (ראש חץ). סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר B) MiniCoopR-EGFP הציל דג זברה עם גידול אמלנוטי ופיגמנטי (ראשי חץ). C) עקומת הישרדות מייצגת ללא מלנומה המשווה בין גידולים המבטאים אונקוגן SETDB1 וגן EGFP מבוקר (p = 9.4×10-7, log-rank χ2).