צביעת נוגדנים של מלנוציטים בקנה מידה: טכניקה לזיהוי גורמי שעתוק המתבטאים במלנוציטים הקשורים לקנה מידה גבי של מודלים של דגי זברה

תקציר

מקור: Sharanya Iyengar et al. בדיקות סקר למלנומה באמצעות מודל גידול אוטוכתוני של דג זברה. J. Vis. Exp. (2012)

סרטון זה מתאר את שיטת צביעת הנוגדנים לזיהוי גורמי שעתוק המתבטאים במלנוציטים הקשורים לקשקשים גביים של מודלים של דגי זברה. טכניקת הצביעה החיסונית הזו מסייעת לזהות באופן ספציפי את גורם הטרנספקציה A הגורם למלנוציטים בדגי הזברה הטרנסגניים.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. צביעת נוגדנים של מלנוציטים בקנה מידה

1. איפור PO₄ חיץ עם 80 מ"ל 0.1M Na₂HPO₄ ו 20 מ"ל 0.1M NaH₂PO₄. ודא שה- pH הוא 7.3. איפור 2x לתקן מאגר המכיל 8.0g סוכרוז, 0.15 מ"ל 0.2M CaCl₂, ו 90 מ"ל 0.2M_{PO 4} חיץ , pH 7.3. במידת הצורך, התאם את ה- pH ל- 7.3 עם NaOH או HCl, ולאחר מכן בצע עד 100 מ"ל עם מאגר PO₄.
2. שוקלים עד 300 מ"ג PFA מוצק ומוסיפים לצינור מיקרוצנטריפוגה. הוסף 5 mM NaOH לנפח השווה ל- 4.5 x מסה, במ"ג, של PFA (למשל 450 ul 5 mM NaOH עד 100 mg PFA). מחממים ב 60-70 מעלות צלזיוס עם רעידות מדי פעם עד PFA מומס. סובבו את החלקיקים הנותרים והשיבו 20% PFA supernatant. הפוך אותו טרי בכל פעם.
3. הכן תמיסת קיבוע המכילה מאגר תיקון 1x ו- 4% PFA.
4. מרדימים את הדג בטריקאין 0.17 מ"ג/מ"ל
.
5. באמצעות שימוש באור אירוע תחת מיקרוסקופ מנתח, קוטפים קשקשים גביים באמצעות מלקחיים חדים ועדינים, תוך הקפדה שלא לפגוע במחצית הסקאלה המכילה מלנוציטים (איור 1A). מניחים את הקשקשים ישירות מהמלקחיים לתמיסת קיבוע של 1 מ"ל ודגרים בטמפרטורת החדר, תוך כדי סיבוב, למשך ≥ שעתיים. העבירו את הדג למי הדגים ועקבו אחר הדגים כדי לוודא התאוששות מוצלחת.
6. כדי להלבין מלנוציטים פיגמנטיים, יש לשטוף קשקשים קבועים ב-PBST (1x PBS pH 7.4, 0.1% Triton X-100) פעמיים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף 1 מ"ל תמיסת אקונומיקה טרייה המכילה 0.4 מ"ל, 10% KOH ו- 0.15 מ"ל 30% H₂O₂ ב- 5 מ"ל עם dH₂O. יש לשים מנעולי פרפילם או מכסה כדי למנוע מגז להתפוצץ בצינורות פתוחים. המשיכו להלבין עד שהפיגמנט נעלם (10 דקות אופייניות) (איור 1B, C). יש לשטוף ב-PBST ארבע פעמים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
7. יש לחסום למשך 30 דקות לפחות בתמיסת בלוקים המורכבת מ-1x PBS pH 7.4, 0.2% Triton X-100, 2 mg/mL BSA, 1% DMSO, 0.02% NaN₃ ו-2% סרום טלה. עזוב את NaN₃ אם אתה מתפתח עם תגובת HRP.
8. יש לדגור עם נוגדן ראשוני בתמיסת בלוק למשך הלילה בטמפרטורת החדר. אתה צריך להיות לפחות 400 μL של תמיסה מעל הדגימות כדי לשמור אותם שקועים.
9. שטפו את הקשקשים 3 פעמים במשך 30 דקות ב-PBST בטמפרטורת החדר.
10. יש לדגור עם נוגדן משני משעתיים עד לילה בתמיסת בלוקים בטמפרטורת החדר.
11. יש להכתים למשך 10 דקות עם PBST + 0.1 μM DAPI.
12. שטפו 3 פעמים במשך 5 דקות עם PBST.
13. הרכיבו את הקשקשים על מגלשת זכוכית בטיפת מגן וקט כך שהצד הקעור של הקשקשים פונה כלפי מטה לכיוון המגלשה והניחו כיסוי זכוכית מחליק מעליהם. אטמו את שולי המגלשה בלק שקוף והתבוננו בשקופיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1D, E, F, G).

תוצאות

איור 1. מכתים נוגדנים של מלנוציטים בקנה מידה. A) קשקשים שנקטפים מדגי זברה זעירים מורדמים. B) אבנית לא מולבנה עם מלנוציטים פיגמנטיים ו-C) אבנית מולבנה מדגי זברה miniCoopR-EGFP. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אבנית לא מולבנה מוכתמת בנוגדן D) Mitfa ו- E) DAPI. אבנית מולבנה מוכתמת בנוגדן F)

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ריאגנטים רקומבינציה שער	Invitrogen
מיני לול
נוגדן Mitfa
נוגדן IgG נגד ארנב עז FITC	Invitrogen
Vectashield	מעבדות וקטוריות	H-1000
דג זברה קספר
מזרק 701N 10 μl	המילטון/פישר	14-824
פ.ב.ס.	Invitrogen	26140079