בדיקת השתלה תת עורית: שיטה להשתלת תאי מלנומה מתורם למודל דג זברה מושתל

תקציר

מקור: Iyengar, S. et al. Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model. J. Vis. Exp. (2012)

סרטון זה מתאר את השיטה להשתלת תאי גידול ממודל דג הזברה התורם נושא המלנומה למושתל מדוכא חיסון דג זברה קספר. זה עוזר לדמיין קליטת הגידול והתפשטות בדגים הנמען.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. בדיקת השתלה

1. הכינו דג קספר בן 2-3 חודשים על ידי הקרנה עם 25 Gy של הקרנת גמא יום אחד לפני ההשתלה. תנו לדגים להתאושש במי הדגים.
2. יש להרדים דג נושא גידול בהתאם להנחיות המוסדיות. באופן ספציפי, דג ממוקם לתוך צלחת עם 0.6 מ"ג / מ"ל טריקאין עד תנועת הזימים מפסיק.
3. חותכים את הגידול ומכניסים אותו לצלחת פטרי עם כ 5 מ"ל מסנן מעוקר 0.9x PBS עם 5% FBS. חותכים את הגידול לקוביות עם סכין גילוח בזמן שהוא בתמיסה.
4. עבודה בטמפרטורת החדר, triturate עם פיפטה P1000 כדי לקבל תאים בודדים. לפצות את נפח עד 25 מ"ל עם מסנן מעוקר 0.9x PBS עם 5% FBS.
5. סנן דרך מסנן רשת שינוי בגודל 40 מיקרומטר.
6. סחרור בצנטריפוגה שולחנית Eppendorf 5810R במהירות 1,500 סל"ד (453 rcf) למשך 10 דקות.
7. הסר את supernatant ולהפוך את התא השעיף לריכוז הרצוי בערך (נניח 10⁷ תאים עבור 100 מ"מ³ גידול).
8. חשב את מספר התא המדויק באמצעות המוציטומטר ודלל את תרחיף התא כך שנפח ההזרקה הסופי הוא כ- 5 μL. לדוגמה, אם רוצים להזריק 50,000 תאים, יש לדלל את תרחיף התאים לריכוז סופי של 10,000 תאים/μL. יש לסובב את הצינור המכיל את תרחיף התא כל כמה דקות כדי למנוע התגבשות של התאים.
9. שטפו מזרק המילטון 26 שניות (קצה משופע) 701 N 10 μL Hamilton 2-3 פעמים עם 100% אתנול ו-0.9x PBS. לטעון את המזרק עם 5 μL של השעיית התא.
10. מרדימים את הדג המושתל המוקרן בטריקאין 0.17 מ"ג/מ"ל. הניחו דגים על צדו על מגבון לח (איור 1A).
11. ייצבו את הדג ביד אחת והכניסו את המחט כשהשיפוע פונה כלפי מעלה בזווית של 45° לתוך צלע הדג שמעל חלל הצפק בערך באמצע הדרך בין הגבול האחורי של המוח האחורי לגבול הקדמי של סנפיר הגב. לחצו בעדינות על הבוכנה (איור 1B).
12. אפשרו לדגים להתאושש במי דגים מתוקים והתבוננו בדגים מדי יום לקליטת הגידול (איור 1C). אם התרחשה קליטה, ניתן לראות גם המשך צמיחה והתפתחות מחלות.

תוצאות

איור 1. השתלת תאי מלנומה. א) דג זברה קספר חד-פעמי. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. B) אתר השתלה תת עורית (ראש חץ) על מושתל קספר מוקרן מיד לאחר הזרקה עם 50,000 תאי מלנומה. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. C) מושתל קספר מוקרן המראה השתלת גידול (ראש חץ) שבועיים לאחר הזרקה עם 50,000 תאי מלנומה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ריאגנטים רקומבינציה שער	Invitrogen
מיני לול
דג זברה קספר
מזרק 701N 10 μl	המילטון/פישר	14-824
מסנן 40 מיקרומטר	BD פלקון/פישר	352340
פ.ב.ס.	Invitrogen	26140079