$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת מדיה וריאגנטים
- הכנת 200x של חומצה L-אסקורבית 2-פוספט סטוק
- יש להמיס 29 מ"ג חומצה L-אסקורבית 2-פוספט לכל 5 מ"ל של תמיסת DMEM (Modified Eagle's Medium) של Dulbecco ולסנן דרך מסנן קרום של 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן כ-0.25 מ"ל aliquots סטריליים בטמפרטורה של -20°C.
- הוסף 0.25 מ"ל aliquot של 200x L-ascorbic חומצה 2-פוספט מלאי לכל 50 מ"ל של מדיה פיברובלסט (DMEM עם 1% L-גלוטמין ו 10% סרום בקר עוברי) ביום הנדרש, לריכוז סופי של 0.1 mM של חומצה L-אסקורבית 2-פוספט.
- הכנת מצע גידול קרטינוציטים
- בידוד ותרבית של קרטינוציטים ראשוניים של תאי קשקש (SCC) תוארו בעבר. הכנת מצע גידול קרטינוציטים מתוארת גם שם.
- בקצרה, להכין את התקשורת כדלקמן:
300 מ"ל DMEM ו-100 מ"ל F-12 של Ham בתוספת 10% FBS
0.4 מ"ג/מ"ל הידרוקורטיזון<בר/>
5 מ"ג / מ"ל אינסולין
10 נ"ג/מ"ל EGF<בר/>
5 מ"ג / מ"ל transferrin
8.4 ננוגרם/מ"ל רעלן כולרה
13 ננוגרם/מ"ל liothyronine
1x תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין
2. בנייה חוץ גופית של מטריצה טבעית הנגזרת מפיברובלסטים בחומצה L-אסקורבית 2-פוספט בתוספת מדיה
- זרעו 200,000 פיברובלסטים לבאר בצלחות 6 בארות (20,000 תאים/ס"מ2) במדיה פיברובלסטית בתוספת חומצה L-אסקורבית 2-פוספט. הזנה מחדש כל 2-3 ימים עם 2-5 מ"ל של מדיה. (הערה: ניתן להתאים את תדירות ההזנה מחדש ואת עוצמת הקול כך שיתאימו לצרכים האישיים של תאים שונים.)
- שכבה עבה של תאים המשובצים במטריצה חוץ-תאית תיווצר בתום 6 שבועות, גלויה לעין בלתי (איור 1). כדי לשחרר שכבה זו מצלחת תרבית הרקמה, לגרד בעדינות את היקף המטריצה עם קצה micropipette 1 מ"ל ולאחר מכן לדחוף את הקצוות של המטריצה לכיוון מרכז הבאר. שכבה זו של תאים ומטריקס (מטריצה מקורית) צריכה להיות ניתנת לניתוק בקלות מפני השטח של הצלחת, וכעת להיות צפה במדיה. פזרו את המטריצה המקורית במדיה כדי למנוע ממנה להתקפל לתוך עצמה.
- תן מטריצה מקורית לצוף ולשפץ במשך 5 ימים, שינוי מדיה כל 2-3 ימים. בשל חוזק המתיחה והשיפוץ הפנימי בתוך המטריצה, המטריצה תתכווץ באופן דרסטי ותצטמצם למטריצה טבעית קטנה יותר, אך עבה יותר, מוכנה לשימוש לבדיקת פלישה.
3. בדיקת פלישה עם קרטינוציטים SCC של הגידול
- מרימים את המטריצה המקורית בעדינות עם מלקחיים קהים ומעבירים לרשת ניילון. ברגע שאתה על רשת הניילון, מורח את המטריצה בעדינות כדי לשכב שטוח ככל האפשר באמצעות קצה micropipette 1 מ"ל ומלקחיים קהה.
- מכינים את גלילי השבט הסטריליים על ידי מריחת כמות קטנה של וזלין סטרילי בקצה אחד.
- מניחים את גלילי השבט על המטריצה המקורית, כאשר הצד של הוזלין כלפי מטה. זאת על מנת להבטיח אטימה הדוקה בין המטריצה המקורית לבין טבעות השבטים.
- הוסף תאי cSCC לגלילי השבט (250,000 תאים ב-100 מיקרוליטר של מצע גידול קרטינוציטים).
- הסר את הצילינדרים המשובטים לאחר 6 שעות כאשר תאי cSCC התיישבו על המטריצה המקורית.
- הרם את רשת הניילון עם המטריצה המקורית ותאי cSCC לממשק אוויר-נוזל על תמיכת רשת תיל נירוסטה כפופה.
- הוסף מצע גידול קרטינוציטים בתוספת חומצה אסקורבית עד שרמת המדיה נוגעת בתחתית המטריצה המקורית.
- שנה מדיה כל 2-3 ימים וקצור ב 7 ו 14 ימים, לאחר זריעה של תאי cSCC.
