מאמר שיטה

הערכה של תפקוד הלב Energetics בלבבות עכבר בודדות שימוש 31 P NMR ספקטרוסקופיה

28.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/2069

⸱

31 באוגוסט 2010

 , 
1Department of Anesthesiology & Pain Medicine, University of Washington School of Medicine

במאמר זה

סיכום

פרופוזיה של לב מבודד במצב Langendorff, בשילוב עם ספקטרוסקופיית 31P NMR, מאחדת את תחומי הביוכימיה והפיזיולוגיה לניסוי אחד. הפרוטוקול מאפשר מדידה דינמית של תכולת פוספט בעלת אנרגיה גבוהה ומחזוריותה בלב, תוך ניטור סימולטני של התפקוד הפיזיולוגי. כאשר היא מבוצעת נכון, טכניקה זו מהווה כלי בעל ערך להערכת האנרגטיקה של הלב.

תקציר

מודלים העכבר bioengineered הפכו כלי מחקר רב עוצמה בקביעת קשרים סיבתיים בין שינויים ומודלים המולקולרי של מחלות לב וכלי דם. למרות הביולוגיה המולקולרית יש צורך בזיהוי שינויים מרכזיים מסלול איתות, זה לא פונדקאית עבור משמעות תפקודית. בעוד הפיזיולוגיה יכולה לספק תשובות לשאלה של פונקציה, תוך שילוב עם הפיזיולוגיה הערכה ביוכימיים של מטבוליטים של שלם, לב פועם מאפשר לקבל תמונה שלמה של תפקוד אנרגטיקה לב. במשך שנים במעבדה שלנו ניצלה perfusions לב מבודדים בשילוב עם ספקטרוסקופית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) כדי לבצע משימה זו. תפקוד חדר שמאל נבחנת על ידי Langendorff מצב perfusions לב מבודדים תוך אנרגטיקה הלב נמדד על ידי ביצוע

פרוטוקול

  1. בניסויים אלה, שתי מערכות נפרדות מנוצלים בעת ובעונה אחת. לרכישת ספקטרום P 31, מגנט 14T Bruker היא interfaced עם III Avance קונסולת מחשב המצויד בתוכנות טופספין v2.1. לקבלת הערכה של תפקוד הלב, זלוף אישית בנוי מערכת הלב interfaced עם PowerLab 4 / 30 רכישת נתונים, מצויד בתוכנה LabChartPro 6 לניתוח נתונים.
  2. ביום הניסוי, 1 ליטר של חיץ קרבס-Henseleit מוכן כדלקמן: 0.5mm EDTA, 5.3mM KCl, 1.2 מ"מ MgSO 4, 118mM NaCl, ו 25mm NaHCO 3. תערובת הוא מבעבע אז עם 5% CO 2 / 95% O 2 במשך 10-15 דקות לפני תוספת של 2 מ"מ CaCl 2. לבסוף, מצעים, בצורה של גלוקוזה 10 מ"מ pyruvate 0.5mm, מתווספים.
  3. ויסות טמפרטורה במהלך הניסוי הוא קריטי. Circulators מחוממת משמשים כדי לשמור על טמפרטורה בין 37.0-37.5 ° C תוך הלב בתוך המגנט. טמפרטורה היא במעקב למשך הניסוי באמצעות בדיקה סיבים אופטיים הטמפרטורה.
  4. לחץ זלוף והלחץ החדר השמאלי מנוטרים באמצעות מתמרים ללחץ המצורפת מערכת נתונים הרכישה מוצג באמצעות תוכנה כלולה. אלו מכוילים עם מד לחץ דם רגיל לפני הניסוי. בנוסף, קווי לחץ סמוקות כראוי על מנת להסיר את כל בועות האוויר.
  5. מדגם סטנדרטי של 150 מ"מ פוספט נתרן (שהוא שווה ערך כוח יוניים של למאגר KH) משמש כדי "לכייל" את החללית לקראת הכניסה של הלב. זה מקל את האות מקטין את הזמן הדרוש כדי להתחיל את תקופת רכישת פעם את הלב ממוקם בתוך החללית.
  6. כדי להפחית קרישת, העכבר מוזרק עם 200 יחידות של ה-IP הפרין אחרי 5 דקות, pentobarbital נתרן (175 מ"ג / ק"ג) IP נתונה.
  7. הלב הוא נכרת במהירות (עם הריאות התימוס שלם) ועצרו בקרח קר KH חיץ.
  8. אמנם שמרה על הקרח, הריאות מוסרים במהירות. אונות התימוס מזוהים קלופים בעדינות לאחור כדי לחשוף את אבי העורקים. התימוס הוא הוסר. אבי העורקים הוא מבודד אז בקפידה על ידי הסרת כל הרקמה שמסביב.
  9. מיקרו תפירת מלקחיים המשמשים בעדינות להחזיק בשני קירות של האאורטה לחשוף את לומן. אבי העורקים ממוקם בזהירות על צינורית עשוי צינורות פוליאתילן OD 0.965 מ"מ (PE50). אבי העורקים נערכת במקום עם מהדק כלי מיקרו בעוד התפרים קשורות במהירות סביב האאורטה. הקליפ הוסר ואת מלקחיים המשמשים לבדוק היטב כי הצינורית הוא מעל שורש האאורטה. קשרים נוספים מתווספים ככל שיידרש כדי להחזיק את הלב במקום.
  10. כל רקמה נוספת היא להסיר באמצעות מלקחיים microscissors. חתך קטן עשה אל החדר השמאלי. 0.61 מ"מ OD צינורות פוליאתילן (PE10) מוחדר בזהירות באמצעות אטריום שמאל, חלל LV, ועל דרך הקודקוד תוך בעדינות מחזיק את הלב. צינורות עודף חיתוך.
  11. בניכוי מלא מים בלון מוחדר דרך אטריום לתוך LV והוא מוחזק במקום באמצעות דבק או תפרים. מהירות המשאבה peristaltic הוא גדל בהדרגה כדי לספק זרימה מספקת ללב. עד הלב הוא המקום לתוך החללית NMR, הלב תמשיך להיות perfused עם זרם בלתי פוסק שווה ערך ל כ 2 מ"ל / דקה. הבלון מנופח LV היא עם נפח קטן באמצעות מזרק מיקרומטר כדי לוודא מתמר הלחץ LV מתפקד.
  12. הלב הוא מוכנס בזהירות לתוך צינור NMR 10 מ"מ. רחב נשא "טווה" משמש כדי להנחות את הצינור למקומו הנכון בתוך החללית. המנגנון כולו אז מחובר היטב "חבל הטבור" עם דבק.
  13. חבל הטבור הוא הוריד לאט לתוך נשא העליון של מגנט עד הצינור לב / NMR נמצא בתוך סליל של בדיקה 10 מ"מ NMR.
  14. לאחר הלב במקום הנכון בתוך החללית, תזרים המשאבה peristaltic מותאם על מנת להשיג בלחץ זלוף של 80mmHg. (זכור, כי עד לנקודה זו את הלב היה perfused עם תזרים קבוע של כ 2 מ"ל / דקה). הלחץ זלוף נשמר אז על ידי הפעלת "להחזיק" מנגנון בבקר המשאבה. הלב הוא מותר אז תקופה איזון 15-20 דקות. במהלך תקופה זו, בהיקף של הבלון LV מותאם להשיג הלחץ סוף דיאסטולי של 80-10 מ"מ כספית.
  15. במהלך התקופה איזון, יש צורך לייעל את הפרמטרים ספקטרומטר על מנת לקבל את האות זרחן הטוב ביותר האפשרי. מטרה זו מושגת על ידי הגדרת הדופק רדיו בתדר בו גרעין זרחן מהדהד ("כוונון") ועושה את השדה המגנטי אחיד ("shimming").
  16. לאחר תקופת איזון, מספר 31 P ספקטרום NMR ניתן להשיג. תקופת הרכישה עבור כל ספקטרום תלויה לאהוא שדה הכוח של המגנט, גודל המדגם, ואת יחס אות לרעש הדרוש לניסוי מסוים. ספקטרה מתקבלים באמצעות מגנט 14 Telsa ידי ממוצעים של האות המתקבל 256 תדירות פולסים של רדיו 20 μs עם זווית להעיף ועיכובים 60 מעלות של 2.0 שניות. ניסוי זה ידרוש כ 10 דקות.

נציג תוצאות

מתוך נתונים על רכישת חומרה ואת התוכנה LabChart, מספר פרמטרים של תפקוד הלב יכול להימדד בכל פרוטוקול הניסוי. למדוד הטיפוסי של תפקוד הלב, החדר השמאלי לחץ המפותחות (LVDevP), מתקבל על ידי הפחתת הלחץ סוף דיאסטולי (EDP) מן הלחץ הסיסטולי (איור 1). צעד זה יכול להשתנות בהתאם זן של העכבר ואת מצב הלב (כלומר, יתר לחץ). עם זאת, LVDevP לב נורמלי C57BL6 העכבר הוא בדרך כלל בין 100-110 מ"מ כספית בלחץ הדיאסטולי סוף קבוע של 80-10 מ"מ כספית. בנוסף, התוכנית מאפשרת LabChart למדידת קצב הלב המבוסס על מדידות מחזורית של גלי לחץ LV. שוב, צעד זה יכול להשתנות אבל הערכים האופייניים הם 350-400 פעימות לדקה כאשר לבבות מותר להכות בשיעורים מהותיים. עם זאת, הלב יכול להיות סטנדרטית באמצעות מערכת לצעוד בו קצב הלב נשמר על 420 פעימות לדקה. בנוסף, אמצעי contractility (+ DP / dt) והרפיה (-dP/dt) ניתן להעריך באמצעות הנגזרת הראשונה של גל הלחץ LV. במהלך פרוטוקול הניסוי קל להעריך את מנגנון סטרלינג על ידי שילוב מערכת יחסים הלחץ נפח. מטרה זו מושגת על ידי ביצוע חשיפה הדרגתית של נפח את הבלון LV ורשם LVDevP וכן EDP. ערכים אלה לאחר מכן ניתן להתוות כמתואר באיור 2. בעוד עקומת סטרלינג הוא אופטימלי, וציין את נפח הדרושים כדי להשיג EDP של 8-10 מ"מ כספית יכולה לתת מושג עקיפה מימד קאמרית LV. ניתן להשתמש במודלים של אבי העורקים banding כמו לבבות שגדלה יתר על המידה בדרך כלל ידרוש נפח בלון קטן בעוד לבבות מורחבים דורשים נפח גדול יותר בהשוואה לקבוצת הביקורת. טבלה 1 מציגה נתונים נציג תפקוד הלב רכשה במהלך הפרוטוקול זלוף.

31 P NMR הספקטרומטר יספק אותות של phosphocreatine (PCR) ושלושה פוספטים מן ה-ATP (γ-ATP, α-ATP, ו - β-ATP) וכן פוספטים אנאורגניים (PI) כפי שמוצג באיור 2. ניתוח של כל אחת מן הפסגות האלה מספק ערך עבור האזור מתחת לעקומה. כמות ה-ATP מוערך על ידי חישוב ממוצע γ-ATP ו - β-ATP אזורים. (Α-ATP אינו משמש כי מולקולות NAD לתרום חלק לא ידוע של האות סה"כ). המצב האנרגטי של הלב נקבע על ידי מנה של PCR אזורי ה-ATP (PCR: יחס ATP). ערך זה הוא בדרך כלל 1.5-1.7 בלב עכבר מסופק עם גלוקוז כמו המצע הראשוני. למרות 31 P התמ"ג אינו מספק אמצעי ישיר של ה-ATP או PCR, באזור של פסגות היא פרופורציונלית לסכום של זרחן המכיל תרכובות במדגם. ערכים עבור אותות אלה יכולים להיות מוערך על ידי שימוש בשיטות אחרות. לדוגמה, אמצעים ישירה של ה-ATP על ידי כרומטוגרפיה ביצועים גבוהים נוזלי (HPLC) במדגם של לבבות יכול להניב הריכוז הממוצע. ערך זה לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לכייל את האזורים הממוצע ATP שנצפתה הספקטרום. ריכוז ה-PCR יכול להיות מחושב על בסיס אזור PCR יחסית לאזור ה-ATP. אפשר גם להעריך את רמת החומציות על ידי ניתוח שינוי כימי יחסית של פוספטים אנאורגניים (PI) אות לאות PCR. 1 שימוש אחר הדופק רדיו רצפים, מהירות התגובה קריאטין קינאז או את מהירות התגובה סינתזה ATP ניתן גם למדוד 2.

טבלה 1
1. Baseline טבלה תפקוד הלב מן הלבבות perfused מבודדים. LVDevP: הלחץ החדר השמאלי מפותח; LVEDP: החדר השמאלי בסוף הלחץ הדיאסטולי, HR: קצב הלב, RPP: הלחץ מוצר קצב; + DP / dt: לחץ first נגזרות LV חיובית; -dP/dt: לחץ first נגזרות LV שלילי; PP : לחץ זלוף: ק"פ: זרימה כלילית.

איור 1
1. איור נציג הלחץ LV גלים מפני תוכנות LabChart Pro.

איור 2
איור 2. עקומות נציג זרזיר מהשלט (קו מוצק) ואת אבי העורקים התאגדו (קו מקווקו) בעכברים. א) פונקציה הסיסטולי כפי שהוא מיוצג על ידי הגדלת נפח LV LVDevP כפי שנקבע על ידי היקף הבלון LV. ב) פונקציה הדיאסטולי כמו מיוצג על ידי EDP על הגדלת נפח LV כפי שנקבע על ידי עוצמת הקול של הבלון LV. LVDevP: הלחץ החדר השמאלי מפותח (סיסטולי ודיאסטולי מינוס pressure); EDP: סוף דיאסטולי לחץ.

איור 3
3. איור 31 נציג P ספקטרום NMR של הלב מבודד עכבר perfused. שימו לב לשיא קטן יחסית Pi. בלב perfused aerobically מסופק עם חומצות שומן או pyruvate בנוסף גלוקוז, שיא זה צריך להיות מינימלי. בתקופות של איסכמיה, זה מגביר את השיא בזמן שיא PCR פוחתת. שימו לב כתף ימין של שיא α-ATP. זוהי תרומתו של מולקולות NAD. Pi: פוספטים אנאורגניים; PCR: phosphocreatine; ה-ATP: אדנוזין טריפוספט.

דיון

ספקטרוסקופיית 31P NMR בלב עכבר מבודד בביצוע פרפוזיה בשיטת Langendorff מספקת נתונים מהימנים וניתנים לשחזור.3, 4 עם זאת, חיוני לבצע את הקניולציה של האאורטה ואת השחלת הבלון לחדר השמאלי (LV) כראוי, כדי לאפשר תפקוד לבבי יציב בעת השהייה בתוך מבחנת ה-NMR. בנוסף, ויסות הטמפרטורה הוא בעל חשיבות עליונה להשגת תפקוד בסיס תקין. גורם חשוב להשגת ספקטראי NMR טובים וניתנים לניתוח הוא הגברת יחס האות לרעש. ניתן להשיג זאת על ידי הבטחת "כוונון" (tuning) ו"שימינג" (shimming) אופטימליים של הדגימה. כפי שצוין בטקסט הפרוטוקול, שימוש בדגימה סטנדרטית לפני השחלת הלב יכול להקל על תהליך זה. כמו כן, מומלץ להשתמש ב"דגימה" בגודל הולם. לבבות השוקלים פחות מ-100 mg מספקים בדרך כלל אותות PCr ו-ATP נמוכים יותר, ולכן יהיה צורך להגדיל את זמן הרכישה כדי לקבל ספקטראי זרחן טובים.

קיימות מספר דרכים לשנות את הפרוטוקול הקיים כדי להשיג מידע נוסף בנוגע לתפקוד הלב ולאנרגטיקה שלו. במעבדה שלנו, ביצענו פרפוזיה ללבבות עם תמיסות סובסטרט מעורבות, שעשויות לכלול שילובים שונים של חומצות שומן (בריכוזים נמוכים וגבוהים), לקטט, קטונים ואינסולין. באמצעות שימוש באיזוטופים יציבים בתמיסת הפרפוזיה (כלומר, סובסטרט המסומן ב-13C), יש לנו את היכולת להעריך את ניצול הסובסטרט על פי התרומה היחסית של acetyl CoA מסומן למחזור ה-TCA.5-7 ליישום זה, אנו מבצעים אנליזת איזוטופומרים של 13C3- ו- 13C4- glutamate באמצעות ספקטרוסקופיית 13C NMR. פעולה זו דורשת קיבוע בהקפאה (freeze-clamping) של הלב בסיום פרוטוקול הפרפוזיה וביצוע מיצוי מהרקמה הקפואה. זה יהיה ניסוי נוסף, שכן האנליזה דורשת שימוש בגרסון (probe) שונה עם פרמטרי הגדרה נפרדים. יישומים אחרים כוללים החלפת גלוקוז ב-deoxyglucose בתמיסה, תוך ניטור הצטברות תלוית-זמן של 2-deoxyglucose phosphate בלב באמצעות ספקטרוסקופיית 31P NMR. שיטה זו מאפשרת מדידה של ספיגת גלוקוז בשריר הלב.7, 8 בנוסף, המעבדה שלנו ניתחה תפקוד לב ואנרגטיקה בפרוטוקולי פרפוזיה הכוללים איסכמיה/reperfusion ואתגר של עומס עבודה גבוה.6, 8-10

לסיכום, ספקטרוסקופיית 31P NMR בלבבות עכברים מבודדים היא הליך מאתגר מבחינה טכנית הדורש שימוש בציוד מתוחכם. עם זאת, הנתונים שהיא מניבה הם בעלי ערך רב עבור החוקר המעוניין לנתח את התפקוד והאנרגטיקה של מודלים של עכברים בהנדסה ביוולוגית. עבור המעבדה שלנו, טכניקות אלו היו חיוניות להבנת ההשלכות של מגוון גורמי עקה על תפקוד הלב, האנרגטיקה והמטבוליזם.1, 11, 12

גילויים

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תודות

המחברים ברצונם להודות ל-Lynne Spencer על תמיכתה במהלך חלק ספקטרוסקופיית ה-NMR של הניסוי. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מה-National Institutes of Health קרנות R01 HL059246, R01 HL067970, R01 HL088634 (לד"ר Tian) ו-F32 HL096284 (לד"ר Kolwicz).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סולפט מагנזיוםריאגנטסייגמה-אלדריץ'M7506
EDTAריאגנטסייגמה-אלדריךE1644
כלוריד אשלגןריאגנטסייגמה-אלדריךP4505
נתרן ביקרבונטריאגנטסייגמה-אלדריץ'S6297
כלוריד נתרןריאגנטסייגמה-אלדריךS7653
כלסידם כלוריד די-הידרטריאגנטסייגמה-אלדריץ'C5080
D-גלוקוזריאגנטסייגמה-אלדריץ'G7528
פירובט נתרןריאגנטסייגמה-אלדריךP2256
ברוקר אולטרה שילד 600WB פלוסציודBruker Corporation
PowerLab 4/30ציודfigure-materials-1 ADInstrumentsML866/P
LabChart 6 Proציודfigure-materials-2 ADInstrumentsMLS260/6
.Quad Bridge Ampציודfigure-materials-3 ADInstrumentsML224
בקר משאבת STHציודfigure-materials-4 ADInstrumentsML175
משאבת פריסטלטית Minipuls 3ציודfigure-materials-5 ADInstrumentsML172
טרנסדיוסר חד-שימושי למדידת לחץ דםציודfigure-materials-6 ADInstrumentsMLT0699
צינורית NMR של 10 מ"מציודWilmad LabGlass513-7PP-7
צינור פוליאתילן PE10ציודBD Biosciences427401
מתמר לחץ פיזיולוגיציודfigure-materials-7 ADInstrumentsMLT844
צינור פוליאתילן PE50ציודBD Biosciences427411
סyrינג מיקרומטריציודGilmont InstrumentsGS-1101
מלקחי מקפרסוןציודMiltex Inc.18-949
מספרים מיקרוסקופיים קסטרוויהוציודחברת כלים ניתוחיים רובוזRS-5650
ממיר אותות נאופטיקסציודNeoptix, Inc.רפלקס - 1

מקורות

  1. Nascimben, L., Ingwall, J. S., Lorell, B. H., Pinz, I., Schultz, V., Tornheim, K., Tian, R. Mechanisms for increased glycolysis in the hypertrophied rat heart. Hypertension. 44, 662-667 (2004).
  2. Spindler, M., Saupe, K. W., Tian, R., Ahmed, S., Matlib, M. A., Ingwall, J. S. Altered creatine kinase enzyme kinetics in diabetic cardiomyopathy. A(31)P NMR magnetization transfer study of the intact beating rat heart. J Mol Cell Cardiol. 31, 2175-2189 (1999).
  3. Ingwall, J. S. Phosphorus nuclear magnetic resonance spectroscopy of cardiac and skeletal muscles. Am J Physiol. 242, H729-H744 (1982).
  4. Ingwall, J. S., Javadpour, M. M., Miao, W. 31P NMR spectroscopy of the mouse heart. Cardiovascular physiology in the genetically engineered. Hoit, B. D., Walsh, R. A. , Kluwer. Boston. 151-163 (2002).
  5. Luptak, I., Balschi, J. A., Xing, Y., Leone, T. C., Kelly, D. P., Tian, R. Decreased contractile and metabolic reserve in peroxisome proliferator-activated receptor-alpha-null hearts can be rescued by increasing glucose transport and utilization. Circulation. 112, 2339-2346 (2005).
  6. Yan, J., Young, M. E., Cui, L., Lopaschuk, G. D., Liao, R., Tian, R. Increased glucose uptake and oxidation in mouse hearts prevent high fatty acid oxidation but cause cardiac dysfunction in diet-induced obesity. Circulation. 119, 2818-2828 (2009).
  7. Luptak, I., Shen, M., He, H., Hirshman, M. F., Musi, N., Goodyear, L. J., Yan, J., Wakimoto, H., Morita, H., Arad, M., Seidman, C. E., Seidman, J. G., Ingwall, J. S., Balschi, J. A., Tian, R. Aberrant activation of AMP-activated protein kinase remodels metabolic network in favor of cardiac glycogen storage. J Clin Invest. 117, 1432-1439 (2007).
  8. Xing, Y., Musi, N., Fujii, N., Zou, L., Luptak, I., Hirshman, M. F., Goodyear, L. J., Tian, R. Glucose metabolism and energy homeostasis in mouse hearts overexpressing dominant negative alpha2 subunit of AMP-activated protein kinase. J Biol Chem. 278, 28372-28377 (2003).
  9. Luptak, I., Yan, J., Cui, L., Jain, M., Liao, R., Tian, R. Long-term effects of increased glucose entry on mouse hearts during normal aging and ischemic stress. Circulation. 116, 901-909 (2007).
  10. Tian, R., Abel, E. D. Responses of GLUT4-deficient hearts to ischemia underscore the importance of glycolysis. Circulation. 103, 2961-2966 (2001).
  11. Liao, R., Jain, M., Cui, L., D'Agostino, J., Aiello, F., Luptak, I., Ngoy, S., Mortensen, R. M., Tian, R. Cardiac-specific overexpression of GLUT1 prevents the development of heart failure attributable to pressure overload in mice. Circulation. 106, 2125-2131 (2002).
  12. Tian, R., Musi, N., D'Agostino, J., Hirshman, M. F., Goodyear, L. J. Increased adenosine monophosphate-activated protein kinase activity in rat hearts with pressure-overload hypertrophy. Circulation. 104, 1664-1669 (2001).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ספקטרוסקופיית 31P NMRפרפוזיית לנגנדורףפוספוקריאטין ATPלחץ ה-LVמבחנת NMRלחץ פרפוזיהקטטר בלון
הערכה של תפקוד הלב Energetics בלבבות עכבר בודדות שימוש 31 P NMR ספקטרוסקופיה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.