הערכה של תפקוד הלב Energetics בלבבות עכבר בודדות שימוש 31 P NMR ספקטרוסקופיה

סיכום

זלוף לב מבודד במצב לנגנדורף, בשילוב עם ספקטרוסקופיה ³¹P NMR, משלב את תחומי הביוכימיה והפיזיולוגיה לניסוי אחד. הפרוטוקול מאפשר מדידה דינמית של תכולת פוספט באנרגיה גבוהה ותחלופה בלב תוך ניטור תפקוד פיזיולוגי. כאשר מבוצעת כהלכה, זוהי טכניקה חשובה בהערכת אנרגטיקה לבבית.

תקציר

מודלים העכבר bioengineered הפכו כלי מחקר רב עוצמה בקביעת קשרים סיבתיים בין שינויים ומודלים המולקולרי של מחלות לב וכלי דם. למרות הביולוגיה המולקולרית יש צורך בזיהוי שינויים מרכזיים מסלול איתות, זה לא פונדקאית עבור משמעות תפקודית. בעוד הפיזיולוגיה יכולה לספק תשובות לשאלה של פונקציה, תוך שילוב עם הפיזיולוגיה הערכה ביוכימיים של מטבוליטים של שלם, לב פועם מאפשר לקבל תמונה שלמה של תפקוד אנרגטיקה לב. במשך שנים במעבדה שלנו ניצלה perfusions לב מבודדים בשילוב עם ספקטרוסקופית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) כדי לבצע משימה זו. תפקוד חדר שמאל נבחנת על ידי Langendorff מצב perfusions לב מבודדים תוך אנרגטיקה הלב נמדד על ידי ביצוע

פרוטוקול

1. בניסויים אלה, שתי מערכות נפרדות מנוצלים בעת ובעונה אחת. לרכישת ספקטרום P ^31, מגנט 14T Bruker היא interfaced עם III Avance קונסולת מחשב המצויד בתוכנות טופספין v2.1. לקבלת הערכה של תפקוד הלב, זלוף אישית בנוי מערכת הלב interfaced עם PowerLab 4 / 30 רכישת נתונים, מצויד בתוכנה LabChartPro 6 לניתוח נתונים.
2. ביום הניסוי, 1 ליטר של חיץ קרבס-Henseleit מוכן כדלקמן: 0.5mm EDTA, 5.3mM KCl, 1.2 מ"מ MgSO _4, 118mM NaCl, ו 25mm NaHCO _3. תערובת הוא מבעבע אז עם 5% CO ₂ / 95% O ₂ במשך 10-15 דקות לפני תוספת של 2 מ"מ CaCl _2. לבסוף, מצעים, בצורה של גלוקוזה 10 מ"מ pyruvate 0.5mm, מתווספים.
3. ויסות טמפרטורה במהלך הניסוי הוא קריטי. Circulators מחוממת משמשים כדי לשמור על טמפרטורה בין 37.0-37.5 ° C תוך הלב בתוך המגנט. טמפרטורה היא במעקב למשך הניסוי באמצעות בדיקה סיבים אופטיים הטמפרטורה.
4. לחץ זלוף והלחץ החדר השמאלי מנוטרים באמצעות מתמרים ללחץ המצורפת מערכת נתונים הרכישה מוצג באמצעות תוכנה כלולה. אלו מכוילים עם מד לחץ דם רגיל לפני הניסוי. בנוסף, קווי לחץ סמוקות כראוי על מנת להסיר את כל בועות האוויר.
5. מדגם סטנדרטי של 150 מ"מ פוספט נתרן (שהוא שווה ערך כוח יוניים של למאגר KH) משמש כדי "לכייל" את החללית לקראת הכניסה של הלב. זה מקל את האות מקטין את הזמן הדרוש כדי להתחיל את תקופת רכישת פעם את הלב ממוקם בתוך החללית.
6. כדי להפחית קרישת, העכבר מוזרק עם 200 יחידות של ה-IP הפרין אחרי 5 דקות, pentobarbital נתרן (175 מ"ג / ק"ג) IP נתונה.
7. הלב הוא נכרת במהירות (עם הריאות התימוס שלם) ועצרו בקרח קר KH חיץ.
8. אמנם שמרה על הקרח, הריאות מוסרים במהירות. אונות התימוס מזוהים קלופים בעדינות לאחור כדי לחשוף את אבי העורקים. התימוס הוא הוסר. אבי העורקים הוא מבודד אז בקפידה על ידי הסרת כל הרקמה שמסביב.
9. מיקרו תפירת מלקחיים המשמשים בעדינות להחזיק בשני קירות של האאורטה לחשוף את לומן. אבי העורקים ממוקם בזהירות על צינורית עשוי צינורות פוליאתילן OD 0.965 מ"מ (PE50). אבי העורקים נערכת במקום עם מהדק כלי מיקרו בעוד התפרים קשורות במהירות סביב האאורטה. הקליפ הוסר ואת מלקחיים המשמשים לבדוק היטב כי הצינורית הוא מעל שורש האאורטה. קשרים נוספים מתווספים ככל שיידרש כדי להחזיק את הלב במקום.
10. כל רקמה נוספת היא להסיר באמצעות מלקחיים microscissors. חתך קטן עשה אל החדר השמאלי. 0.61 מ"מ OD צינורות פוליאתילן (PE10) מוחדר בזהירות באמצעות אטריום שמאל, חלל LV, ועל דרך הקודקוד תוך בעדינות מחזיק את הלב. צינורות עודף חיתוך.
11. בניכוי מלא מים בלון מוחדר דרך אטריום לתוך LV והוא מוחזק במקום באמצעות דבק או תפרים. מהירות המשאבה peristaltic הוא גדל בהדרגה כדי לספק זרימה מספקת ללב. עד הלב הוא המקום לתוך החללית NMR, הלב תמשיך להיות perfused עם זרם בלתי פוסק שווה ערך ל כ 2 מ"ל / דקה. הבלון מנופח LV היא עם נפח קטן באמצעות מזרק מיקרומטר כדי לוודא מתמר הלחץ LV מתפקד.
12. הלב הוא מוכנס בזהירות לתוך צינור NMR 10 מ"מ. רחב נשא "טווה" משמש כדי להנחות את הצינור למקומו הנכון בתוך החללית. המנגנון כולו אז מחובר היטב "חבל הטבור" עם דבק.
13. חבל הטבור הוא הוריד לאט לתוך נשא העליון של מגנט עד הצינור לב / NMR נמצא בתוך סליל של בדיקה 10 מ"מ NMR.
14. לאחר הלב במקום הנכון בתוך החללית, תזרים המשאבה peristaltic מותאם על מנת להשיג בלחץ זלוף של 80mmHg. (זכור, כי עד לנקודה זו את הלב היה perfused עם תזרים קבוע של כ 2 מ"ל / דקה). הלחץ זלוף נשמר אז על ידי הפעלת "להחזיק" מנגנון בבקר המשאבה. הלב הוא מותר אז תקופה איזון 15-20 דקות. במהלך תקופה זו, בהיקף של הבלון LV מותאם להשיג הלחץ סוף דיאסטולי של 80-10 מ"מ כספית.
15. במהלך התקופה איזון, יש צורך לייעל את הפרמטרים ספקטרומטר על מנת לקבל את האות זרחן הטוב ביותר האפשרי. מטרה זו מושגת על ידי הגדרת הדופק רדיו בתדר בו גרעין זרחן מהדהד ("כוונון") ועושה את השדה המגנטי אחיד ("shimming").
16. לאחר תקופת איזון, מספר ³¹ P ספקטרום NMR ניתן להשיג. תקופת הרכישה עבור כל ספקטרום תלויה לאהוא שדה הכוח של המגנט, גודל המדגם, ואת יחס אות לרעש הדרוש לניסוי מסוים. ספקטרה מתקבלים באמצעות מגנט 14 Telsa ידי ממוצעים של האות המתקבל 256 תדירות פולסים של רדיו 20 μs עם זווית להעיף ועיכובים 60 מעלות של 2.0 שניות. ניסוי זה ידרוש כ 10 דקות.

נציג תוצאות

מתוך נתונים על רכישת חומרה ואת התוכנה LabChart, מספר פרמטרים של תפקוד הלב יכול להימדד בכל פרוטוקול הניסוי. למדוד הטיפוסי של תפקוד הלב, החדר השמאלי לחץ המפותחות (LVDevP), מתקבל על ידי הפחתת הלחץ סוף דיאסטולי (EDP) מן הלחץ הסיסטולי (איור 1). צעד זה יכול להשתנות בהתאם זן של העכבר ואת מצב הלב (כלומר, יתר לחץ). עם זאת, LVDevP לב נורמלי C57BL6 העכבר הוא בדרך כלל בין 100-110 מ"מ כספית בלחץ הדיאסטולי סוף קבוע של 80-10 מ"מ כספית. בנוסף, התוכנית מאפשרת LabChart למדידת קצב הלב המבוסס על מדידות מחזורית של גלי לחץ LV. שוב, צעד זה יכול להשתנות אבל הערכים האופייניים הם 350-400 פעימות לדקה כאשר לבבות מותר להכות בשיעורים מהותיים. עם זאת, הלב יכול להיות סטנדרטית באמצעות מערכת לצעוד בו קצב הלב נשמר על 420 פעימות לדקה. בנוסף, אמצעי contractility (+ DP / dt) והרפיה (-dP/dt) ניתן להעריך באמצעות הנגזרת הראשונה של גל הלחץ LV. במהלך פרוטוקול הניסוי קל להעריך את מנגנון סטרלינג על ידי שילוב מערכת יחסים הלחץ נפח. מטרה זו מושגת על ידי ביצוע חשיפה הדרגתית של נפח את הבלון LV ורשם LVDevP וכן EDP. ערכים אלה לאחר מכן ניתן להתוות כמתואר באיור 2. בעוד עקומת סטרלינג הוא אופטימלי, וציין את נפח הדרושים כדי להשיג EDP של 8-10 מ"מ כספית יכולה לתת מושג עקיפה מימד קאמרית LV. ניתן להשתמש במודלים של אבי העורקים banding כמו לבבות שגדלה יתר על המידה בדרך כלל ידרוש נפח בלון קטן בעוד לבבות מורחבים דורשים נפח גדול יותר בהשוואה לקבוצת הביקורת. טבלה 1 מציגה נתונים נציג תפקוד הלב רכשה במהלך הפרוטוקול זלוף.

³¹ P NMR הספקטרומטר יספק אותות של phosphocreatine (PCR) ושלושה פוספטים מן ה-ATP (γ-ATP, α-ATP, ו - β-ATP) וכן פוספטים אנאורגניים (PI) כפי שמוצג באיור 2. ניתוח של כל אחת מן הפסגות האלה מספק ערך עבור האזור מתחת לעקומה. כמות ה-ATP מוערך על ידי חישוב ממוצע γ-ATP ו - β-ATP אזורים. (Α-ATP אינו משמש כי מולקולות NAD לתרום חלק לא ידוע של האות סה"כ). המצב האנרגטי של הלב נקבע על ידי מנה של PCR אזורי ה-ATP (PCR: יחס ATP). ערך זה הוא בדרך כלל 1.5-1.7 בלב עכבר מסופק עם גלוקוז כמו המצע הראשוני. למרות ³¹ P התמ"ג אינו מספק אמצעי ישיר של ה-ATP או PCR, באזור של פסגות היא פרופורציונלית לסכום של זרחן המכיל תרכובות במדגם. ערכים עבור אותות אלה יכולים להיות מוערך על ידי שימוש בשיטות אחרות. לדוגמה, אמצעים ישירה של ה-ATP על ידי כרומטוגרפיה ביצועים גבוהים נוזלי (HPLC) במדגם של לבבות יכול להניב הריכוז הממוצע. ערך זה לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לכייל את האזורים הממוצע ATP שנצפתה הספקטרום. ריכוז ה-PCR יכול להיות מחושב על בסיס אזור PCR יחסית לאזור ה-ATP. אפשר גם להעריך את רמת החומציות על ידי ניתוח שינוי כימי יחסית של פוספטים אנאורגניים (PI) אות לאות PCR. ¹ שימוש אחר הדופק רדיו רצפים, מהירות התגובה קריאטין קינאז או את מהירות התגובה סינתזה ATP ניתן גם למדוד ^2.

1. Baseline טבלה תפקוד הלב מן הלבבות perfused מבודדים. LVDevP: הלחץ החדר השמאלי מפותח; LVEDP: החדר השמאלי בסוף הלחץ הדיאסטולי, HR: קצב הלב, RPP: הלחץ מוצר קצב; + DP / dt: לחץ first נגזרות LV חיובית; -dP/dt: לחץ first נגזרות LV שלילי; PP : לחץ זלוף: ק"פ: זרימה כלילית.

1. איור נציג הלחץ LV גלים מפני תוכנות LabChart Pro.

איור 2. עקומות נציג זרזיר מהשלט (קו מוצק) ואת אבי העורקים התאגדו (קו מקווקו) בעכברים. א) פונקציה הסיסטולי כפי שהוא מיוצג על ידי הגדלת נפח LV LVDevP כפי שנקבע על ידי היקף הבלון LV. ב) פונקציה הדיאסטולי כמו מיוצג על ידי EDP על הגדלת נפח LV כפי שנקבע על ידי עוצמת הקול של הבלון LV. LVDevP: הלחץ החדר השמאלי מפותח (סיסטולי ודיאסטולי מינוס pressure); EDP: סוף דיאסטולי לחץ.

3. איור ³¹ נציג P ספקטרום NMR של הלב מבודד עכבר perfused. שימו לב לשיא קטן יחסית Pi. בלב perfused aerobically מסופק עם חומצות שומן או pyruvate בנוסף גלוקוז, שיא זה צריך להיות מינימלי. בתקופות של איסכמיה, זה מגביר את השיא בזמן שיא PCR פוחתת. שימו לב כתף ימין של שיא α-ATP. זוהי תרומתו של מולקולות NAD. Pi: פוספטים אנאורגניים; PCR: phosphocreatine; ה-ATP: אדנוזין טריפוספט.

דיון

³¹ספקטרוסקופיה P NMR בלב העכבר המבודד של לנגנדורף מספקת נתונים אמינים וניתנים לשחזור. ^{3, 4} עם זאת, הכרחי שקנולציה של אבי העורקים והחדרת בלון ה-LV ייעשו כראוי כדי לאפשר ביצועי לב יציבים בתוך צינור ה-NMR. בנוסף, ויסות הטמפרטורה הוא בעל חשיבות עליונה על מנת להשיג תפקוד בסיסי תקין. גורם חשוב אחד בהשגת ספקטרום NMR טוב וניתן לניתוח הוא הגדלת יחס האות לרעש. ניתן להשיג זאת על ידי הבטחת "כוונון" ו"שימינג "אופטימליים על הדגימה. כפי שהוזכר בטקסט הפרוטוקול, שימוש בדגימה סטנדרטית לפני החדרת הלב יכול להקל על כך. זה גם מועיל שיהיה "מדגם" בגודל מתאים. לבבות במשקל של פחות מ-100 מ"ג מספקים בדרך כלל אותות PCr ו-ATP נמוכים יותר, כך שיהיה צורך להגדיל את זמן הרכישה כדי להשיג ספקטרום זרחן טוב.

ישנן מספר דרכים לשנות את הפרוטוקול הקיים כדי לאסוף מידע נוסף לגבי תפקוד הלב והאנרגיה. במעבדה שלנו, יש לנו לבבות מעורבים עם חוצצי סובסטרט מעורבים שיכולים לכלול נוכחות של שילובים שונים של חומצות שומן (בריכוזים נמוכים וגבוהים), לקטט, קטונים ואינסולין. עם שימוש באיזוטופים יציבים במאגר הזלוף (כלומר, ¹³מצעים מסומנים C), יש לנו את היכולת להעריך את ניצול המצע על ידי התרומה היחסית של אצטיל CoA מסומן למחזור TCA. ^5-7 עבור יישום זה, אנו מבצעים ניתוח איזוטופומר של ¹³C3- ^ו-13C4- גלוטמט עם ספקטרוסקופיה של ¹³C NMR. זה דורש הידוק הקפאה של הלב בסוף פרוטוקול הזלוף וביצוע מיצוי של הרקמה הקפואה. זה יהיה ניסוי נוסף מכיוון שהניתוח דורש שימוש בבדיקה אחרת עם פרמטרי הגדרה נפרדים. יישומים אחרים כוללים החלפת גלוקוז בדאוקסיגלוקוז במאגר תוך ניטור הצטברות תלוית זמן של 2-דאוקסיגלוקוז פוספט בלב באמצעות ספקטרוסקופיה ³¹P NMR. שיטה זו מאפשרת למדוד את ספיגת הגלוקוז בשריר הלב. ^{7, 8} בנוסף, המעבדה שלנו ניתחה את תפקוד הלב והאנרגיה בפרוטוקולי זלוף המורכבים מאיסכמיה/רפרפוזיה ואתגר עומס עבודה גבוה. ^{6, 8-10}

לסיכום, ספקטרוסקופיה ³¹P NMR בלבבות עכברים מבודדים היא הליך מאתגר מבחינה טכנית הדורש שימוש בציוד מתוחכם. עם זאת, הנתונים שהוא מניב הם בעלי ערך רב לחוקר המבקש לנתח את התפקוד והאנרגיה של מודלים של עכברים מהונדסים ביולוגית. עבור המעבדה שלנו, טכניקות אלה היו חיוניות להבנתנו את ההשלכות של מגוון גורמי לחץ על תפקוד הלב, האנרגיה וחילוף החומרים. ^{1, 11, 12}

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מגיב	מגנזיום גופרתי	Sigma-Aldrich	M7506
EDTA	מגיב	Sigma-Aldrich	E1644
מגיב אשלגן כלורי		Sigma-Aldrich	P4505
מגיב נתרן ביקרבונט		Sigma-Aldrich	S6297
מגיב נתרן כלורי		סיגמא-אולדריץ	S7653
סידן כלוריד דיהידראט	ריאגנט	סיגמא-אולדריץ'	C5080
D-גלוקוז	ריאגנט	סיגמא-אולדריץ'	G7528
נתרן פירובט	ריאגנט	סיגמא-אולדריץ'	P2256
ברוקר אולטרה-שילד 600WB פלוס	ציוד	Bruker Corporation
PowerLab 4/30	Equipment	ADInstruments	ML866/P
LabChart 6 Pro	Equipment	ADInstruments	MLS260/6
Quad Bridge Amp	Equipment	ADInstruments	ML224
STH Pump Controller	Equipment	ADInstruments	ML175
Minipuls 3 Peristaltic Pump	Equipment	ADInstruments	ML172
מתמר לחץ דם חד פעמי	ציוד	ADInstruments	MLT0699
10 מ"מ ציוד צינור מדגם NMR	Wilmad	LabGlass	513-7PP-7
צינורות פוליאתילן PE10	ציוד	BD Biosciences	427401
מתמר לחץ פיזיולוגי	ציוד	ADInstruments	MLT844
צינורות פוליאתילן PE50	ציוד	BD Biosciences	427411
ציוד מזרק מיקרומטר		Gilmont Instruments	GS-1101
ציוד מלקחיים מקפרסון		Miltex Inc.	18-949
Castraviejo מיקרומספריים	ציוד	Roboz מכשירים כירורגיים ושות'	RS-5650
ציוד מרכך אותות Neoptix		Neoptix, Inc.	רפלקס - 1