במאמר זה, אנו מציגים שיטה להפוך מחטים נימי זכוכית עם לומן 50 מיקרומטר. טכניקה זו מפחיתה באופן משמעותי את הנזק המוחי, ממזער דיפוזיה פסיבית של תרופות ומאפשרת מיקוד מדויק לתוך המוח מכרסמים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מיקוד של מבנים מוחיים עמוקים עם Microinjections עבור משלוח של תרופות, וקטורים ויראליים, או השתלת תאים
במאמר זה
סיכום
תקציר
Microinjections parenchyma לתוך המוח הם הליכים חשובים כדי לספק תרופות, וקטורים ויראליים או השתלות תאים. הנגע במוח מחט הזרקת מייצרת במהלך מסלולו הוא החשש העיקרי במיוחד במוח העכבר לא רק המוח הוא קטן, אבל גם לפעמים זריקות מרובות נדרשים. אנחנו מראים כאן שיטה לייצר מחטים נימי זכוכית עם 50 מיקרומטר לומן אשר מפחית באופן משמעותי את הנזק המוחי ומאפשרת מיקוד מדויק לתוך המוח מכרסמים. שיטה זו מאפשרת משלוח של בנפחים קטנים (20-100 nl), מפחיתה את הסיכון לדימום, וממזער דיפוזיה פסיבית של תרופות לתוך parenchyma המוח. באמצעות גודל שונים של צינורות זכוכית נימי, או שינוי לומן מחט, מספר סוגים של חומרים ותאי ניתן להזריק. Microinjections עם צינור זכוכית נימי מייצגים שיפור משמעותי טכניקות ההזרקה והמוח עמוק מיקוד עם נזק סביבתי מינימלי מכרסמים קטנים.
פרוטוקול
- הפוך את מחטי הזכוכית לפני הניתוח העכבר:
- שים את שפופרת זכוכית נימי ב חולץ micropipette.
- מחממים את האמצעי של צינור זכוכית כדי לרכך את שפופרת זכוכית באזור מקומי.
- למתוח את שפופרת זכוכית לאורך ציר האורך שלה על ידי מרחק ראשונית מספיק כדי לגרום לירידה בקוטר של צינור זכוכית באזור מקומי.
- שמור מתיחת שפופרת זכוכית עד שהיא נשברת. בדרך זו, שתי מחטים זהה חבית בודדת מתקבלים.
- שים את המחט זכוכית microforge. זווית 30 מעלות זה מספיק כדי שפוע קצה.
- בדוק תחת מיקרוסקופ כי מחט לכל הקוטר הפנימי הנכון. במשך רוב התרופות הידרופילי בקוטר 30-50 מיקרומטר פנימי אידיאלי (איור 1).
- מלאו את המחט עם שמן מינרלי מהקצה הרחב ביותר של מחט זכוכית. בואו כי שמן מינרלי (MSDS, חתול. M7700) נכנס ידי קפילריות עד שהוא מגיע ~ 50% אורך הצינור נימי. שים גבוהה ואקום שומן (Dow Corning, חתול. 05054-AB) סביב הבוכנה לאטום את סוף רחב של המחט.
- הכנס את הבוכנה עד סוף רחב של המחט ולדחוף שמן מינרלי בעדינות עד טיפה קטנה של שמן נראה יוצא של קצה המחט זכוכית.
- אבטח את מחט זכוכית בעל microinjector.
- להרדים את העכבר עם Avertin 2.5% (2,2,2-tribromoethanol + טרט-אמיל אלכוהול, 01:01 w / v). Dosis 25-30μL לכל intraperitoneal גרם.
- שימי כרית חימום על המכשיר stereotactic לשמור על טמפרטורת הגוף של בעל החיים ב 37 ° C.
- המקום ומאובטח ראש עכבר במכשיר stereotactic באמצעות מוטות האוזן בעל שיניים.
- נקו את הראש עם העכבר פתרון 0.1% chlorhexidine gluconate, ואחריו 70% אתנול ו gluconate chlorhexidine 0.1% בפעם השנייה.
- לחתוך את העור עם להב כירורגי # 15 מהאוזניים העכבר לקו הגולגולת Lamba.
- הפולנים את הגולגולת עם חילופי כותנה לייבש אותו ולמשוך העור מתוך בתחום כירורגית.
- השתמש קצה המחט זכוכית להצביע על הקודקוד של תפר גבחת. יש לך להגדיר את המיקום הראשוני של מזרק (לתאם "אפס").
- הגדר את הצבע לקידוח ידי הזזת "X" ו - "Y" ציר של המכשיר stereotactic על הגולגולת.
- מקדחה בזהירות רבה חורים לתאם שנבחר. Microdrills וכלי מתכת אחרים עוקרו בעבר ב 250 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות עם כוס יבש חרוז מעקר (קול פאלמר, חתול. מס 'EW-10779-00).
- בעזרת מלקחיים בסדר להסיר בזהירות את השכבה העמוקה ביותר של עצם לשבור את קרום duramatter (תראה כמה נוזל השדרה מוחין דולף החוצה).
- ודא מחט יכול לעבור חורים שנקדחו.
- פיפטה 1 μl של התרופה אתה רוצה להזריק והניח אותו על חתיכה קטנה של parafilm.
- שים את parafilm על הגולגולת.
- תמצצי את התרופה על ידי מסובב את הגלגל microinjector, בעוד לך לבדוק תחת מיקרוסקופ כי הנוזל הולך לתוך מחט זכוכית.
- הסר את parafilm מחדש להגדיר את לתאם אפס.
- הזז את המחט עד הקואורדינטות שנבחרה, מחזיק מטה עד קצה מחט זכוכית בעדינות לגעת במשטח המוח להגדיר את "Z" לתאם אפס.
- הציגו את המחט לתוך כוס parenchyma המוח בעומק שנבחר.
- להזריק את התרופה באיטיות בקצב של ~ 1 nl / sec.
- כאשר נפח רצון מוזרק, אפשר לפזר סמים לתוך parenchyma במשך 2 דקות. ואז להמשיך להוציא את המחט בצורה חלקה לאט.
- דבק את הפצע כירורגי ולהסיר את החיה מהמכשיר stereotactic ולשים את חיה בכלוב מחומם מראש ובו מיטה נקייה להתאוששות הרדמה.
- כדי לספק שיכוך כאבים שלאחר הניתוח חיות קיבלו 5 מ"ג / ק"ג תת עורית Ketorolac כל שעה 12 ל 24 ח
נציג תוצאות:
כאשר בעקבות פרוטוקול זה, הזרקה מדויקת מאוד מתקבל ומסלול מחט צר מאוד מצמצם פגיעה מוחית. כתוצאה מכך נציג של שיטה זו, אנו מזריקים lysophosphatidyl כולין (lysolecithin) לתוך כפיס המוח שמייצר demyelination של קטעי החומר הלבן 1-4. כדי למזער את הפגיעה המוחית המיוצר על ידי מחט זכוכית, אנו מזריקים רק 20 nl של lysolecithin אל כפיס המוח, אבל אם כרכים גבוה ככל הנדרש 200 nl יהיה ניתן להזריק בשיטה זהה. Demyelination הוא זוהה על ידי הנעדר של ביטוי חלבון המיאלין הבסיסי קטעי החומר הלבן (איור 2).
באיור 1. מחט זכוכית בקוטר של 50 מיקרומטר. מרחק בין שתי קרציות קצרבסולם מייצג באורך 50 מיקרומטר.
2. איור Lysolecithin הזרקת כפיס המוח. Demyelination מוצג ביטוי לא חלבון המיאלין הבסיסי (שטח מקווקו). שים לב גודל קטן בדרכי מחט זכוכית (חיצים). בר = 100 מיקרומטר
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שיטה הראו בסרטון הזה הוא מאוד שימושי כדי לספק את רוב סמים או וקטורים ויראליים למקומות מאוד מדויק לתוך המוח. חלק מן היתרונות העיקריים של השיטה הזו הן אמינות של נקודת המיקוד, את הדיוק של זריקות ואת גודל קטן של פגיעה מוחית ולנזק בדרכי 1, 2, 5, 6. לאחר הטכניקה היא סטנדרטית את טווח Mistargeting צריך 50 מיקרומטר או פחות 1, 2. השתלות תאים יכול להעשות גם באמצעות הרחבה, 100-150 מיקרומטר 7-9, מחטים. מסירה תאים יעיל לכן ניתן להפקיד לתוך ספציפיים מאוד מזעור הנ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
OG-P נתמך על ידי מענק של CONACyT (CB-2008-101476) ו FRABA (686/10). AQ-H נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות בארה"ב, הווארד יוז רפואי במכון, רוברט ווד ג'ונסון קרן וקרן תא גזע מרילנד.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צינורית זכוכית קפילרית | Wiretrol I | 5-000-1001 | |
| מכשיר למשכה של מיקרופיפטות | Kopf Instruments | דגם 730 | |
| מיקרו-פורג' (Microforge) | World Precision Instruments, Inc. | דגם 48000 | |
| שמן מינרלי | גיליון בטיחות חומרים (MSDS) | M7700 | |
| גריס לוואקום גבוה | Dow Corning | 05054-AB | |
| הרדמה: 2.5% Avertin | 2,2,2-טריברומו–אתנול + tert-amyl alcohol, 1:1 w/v | ||
| פד חימום | Mastex | דגם 900 | |
| מכשיר סטריאוטקטי | Kopf Instruments | דגם Kopf-900 | |
| להב סכין כירורגי מס' 15 | Medi-Cut | ||
| מקדח מיקרו (Micro driller) | מקדח מיקרו אידיאלי | 67-1000 | |
| פינצטה עדינה | Fine Science Tools | ||
| 1-μמיקרופיפט L | Rainin | ||
| Parafilm M. | |||
| מיקרוסקופ כירורגי | Carl Zeiss, Inc. | ואסיוקופייה באמצעות מערכת Contraves | |
| מיקרו-מזרק | Narishige International | דגם MO-10 |
מקורות
- Menn, B. Origin of oligodendrocytes in the subventricular zone of the adult brain. J Neurosci. 26, 7907-7918 (2006).
- Gonzalez-Perez, O., Romero-Rodriguez, R., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Epidermal Growth Factor Induces the Progeny of Subventricular Zone Type B Cells to Migrate and Differentiate into Oligodendrocytes. Stem Cells. 27, 2032-2043 (2009).
- Hall, S. M. Some aspects of remyelination after demyelination produced by the intraneural injection of lysophosphatidyl choline. J Cell Sci. 13, 461-477 (1973).
- Webster, G. R., Thompson, R. H. Observations on the presence of lysolecithin in nervous tissues. Biochim Biophys Acta. 63, 38-45 (1962).
- Doetsch, F., Caille, I., Lim, D. A., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Subventricular Zone Astrocytes Are Neural Stem Cells in the Adult mammalian Brain. Cell. 97, 1-20 (1999).
- Doetsch, F., Petreanu, L., Caille, I., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells. Neuron. 36, 1021-1034 (2002).
- Baraban, S. C. Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 15472-15477 (2009).
- Richardson, R. M., Barbaro, N. M., Alvarez-Buylla, A., Baraban, S. C. Developing cell transplantation for temporal lobe epilepsy. Neurosurg Focus. 24, E17-E17 (2008).
- Alvarez-Dolado, M. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J Neurosci. 26, 7380-7389 (2006).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
