מיקוד של מבנים מוחיים עמוקים עם Microinjections עבור משלוח של תרופות, וקטורים ויראליים, או השתלת תאים

סיכום

במאמר זה, אנו מציגים שיטה להפוך מחטים נימי זכוכית עם לומן 50 מיקרומטר. טכניקה זו מפחיתה באופן משמעותי את הנזק המוחי, ממזער דיפוזיה פסיבית של תרופות ומאפשרת מיקוד מדויק לתוך המוח מכרסמים.

תקציר

Microinjections parenchyma לתוך המוח הם הליכים חשובים כדי לספק תרופות, וקטורים ויראליים או השתלות תאים. הנגע במוח מחט הזרקת מייצרת במהלך מסלולו הוא החשש העיקרי במיוחד במוח העכבר לא רק המוח הוא קטן, אבל גם לפעמים זריקות מרובות נדרשים. אנחנו מראים כאן שיטה לייצר מחטים נימי זכוכית עם 50 מיקרומטר לומן אשר מפחית באופן משמעותי את הנזק המוחי ומאפשרת מיקוד מדויק לתוך המוח מכרסמים. שיטה זו מאפשרת משלוח של בנפחים קטנים (20-100 nl), מפחיתה את הסיכון לדימום, וממזער דיפוזיה פסיבית של תרופות לתוך parenchyma המוח. באמצעות גודל שונים של צינורות זכוכית נימי, או שינוי לומן מחט, מספר סוגים של חומרים ותאי ניתן להזריק. Microinjections עם צינור זכוכית נימי מייצגים שיפור משמעותי טכניקות ההזרקה והמוח עמוק מיקוד עם נזק סביבתי מינימלי מכרסמים קטנים.

פרוטוקול

1. הפוך את מחטי הזכוכית לפני הניתוח העכבר:
   1. שים את שפופרת זכוכית נימי ב חולץ micropipette.
   2. מחממים את האמצעי של צינור זכוכית כדי לרכך את שפופרת זכוכית באזור מקומי.
   3. למתוח את שפופרת זכוכית לאורך ציר האורך שלה על ידי מרחק ראשונית מספיק כדי לגרום לירידה בקוטר של צינור זכוכית באזור מקומי.
   4. שמור מתיחת שפופרת זכוכית עד שהיא נשברת. בדרך זו, שתי מחטים זהה חבית בודדת מתקבלים.
2. שים את המחט זכוכית microforge. זווית 30 מעלות זה מספיק כדי שפוע קצה.
3. בדוק תחת מיקרוסקופ כי מחט לכל הקוטר הפנימי הנכון. במשך רוב התרופות הידרופילי בקוטר 30-50 מיקרומטר פנימי אידיאלי (איור 1).
4. מלאו את המחט עם שמן מינרלי מהקצה הרחב ביותר של מחט זכוכית. בואו כי שמן מינרלי (MSDS, חתול. M7700) נכנס ידי קפילריות עד שהוא מגיע ~ 50% אורך הצינור נימי. שים גבוהה ואקום שומן (Dow Corning, חתול. 05054-AB) סביב הבוכנה לאטום את סוף רחב של המחט.
5. הכנס את הבוכנה עד סוף רחב של המחט ולדחוף שמן מינרלי בעדינות עד טיפה קטנה של שמן נראה יוצא של קצה המחט זכוכית.
6. אבטח את מחט זכוכית בעל microinjector.
7. להרדים את העכבר עם Avertin 2.5% (2,2,2-tribromoethanol + טרט-אמיל אלכוהול, 01:01 w / v). Dosis 25-30μL לכל intraperitoneal גרם.
8. שימי כרית חימום על המכשיר stereotactic לשמור על טמפרטורת הגוף של בעל החיים ב 37 ° C.
9. המקום ומאובטח ראש עכבר במכשיר stereotactic באמצעות מוטות האוזן בעל שיניים.
10. נקו את הראש עם העכבר פתרון 0.1% chlorhexidine gluconate, ואחריו 70% אתנול ו gluconate chlorhexidine 0.1% בפעם השנייה.
11. לחתוך את העור עם להב כירורגי # 15 מהאוזניים העכבר לקו הגולגולת Lamba.
12. הפולנים את הגולגולת עם חילופי כותנה לייבש אותו ולמשוך העור מתוך בתחום כירורגית.
13. השתמש קצה המחט זכוכית להצביע על הקודקוד של תפר גבחת. יש לך להגדיר את המיקום הראשוני של מזרק (לתאם "אפס").
14. הגדר את הצבע לקידוח ידי הזזת "X" ו - "Y" ציר של המכשיר stereotactic על הגולגולת.
15. מקדחה בזהירות רבה חורים לתאם שנבחר. Microdrills וכלי מתכת אחרים עוקרו בעבר ב 250 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות עם כוס יבש חרוז מעקר (קול פאלמר, חתול. מס 'EW-10779-00).
16. בעזרת מלקחיים בסדר להסיר בזהירות את השכבה העמוקה ביותר של עצם לשבור את קרום duramatter (תראה כמה נוזל השדרה מוחין דולף החוצה).
17. ודא מחט יכול לעבור חורים שנקדחו.
18. פיפטה 1 μl של התרופה אתה רוצה להזריק והניח אותו על חתיכה קטנה של parafilm.
19. שים את parafilm על הגולגולת.
20. תמצצי את התרופה על ידי מסובב את הגלגל microinjector, בעוד לך לבדוק תחת מיקרוסקופ כי הנוזל הולך לתוך מחט זכוכית.
21. הסר את parafilm מחדש להגדיר את לתאם אפס.
22. הזז את המחט עד הקואורדינטות שנבחרה, מחזיק מטה עד קצה מחט זכוכית בעדינות לגעת במשטח המוח להגדיר את "Z" לתאם אפס.
23. הציגו את המחט לתוך כוס parenchyma המוח בעומק שנבחר.
24. להזריק את התרופה באיטיות בקצב של ~ 1 nl / sec.
25. כאשר נפח רצון מוזרק, אפשר לפזר סמים לתוך parenchyma במשך 2 דקות. ואז להמשיך להוציא את המחט בצורה חלקה לאט.
26. דבק את הפצע כירורגי ולהסיר את החיה מהמכשיר stereotactic ולשים את חיה בכלוב מחומם מראש ובו מיטה נקייה להתאוששות הרדמה.
27. כדי לספק שיכוך כאבים שלאחר הניתוח חיות קיבלו 5 מ"ג / ק"ג תת עורית Ketorolac כל שעה 12 ל 24 ח

נציג תוצאות:

כאשר בעקבות פרוטוקול זה, הזרקה מדויקת מאוד מתקבל ומסלול מחט צר מאוד מצמצם פגיעה מוחית. כתוצאה מכך נציג של שיטה זו, אנו מזריקים lysophosphatidyl כולין (lysolecithin) לתוך כפיס המוח שמייצר demyelination של קטעי החומר הלבן 1-4. כדי למזער את הפגיעה המוחית המיוצר על ידי מחט זכוכית, אנו מזריקים רק 20 nl של lysolecithin אל כפיס המוח, אבל אם כרכים גבוה ככל הנדרש 200 nl יהיה ניתן להזריק בשיטה זהה. Demyelination הוא זוהה על ידי הנעדר של ביטוי חלבון המיאלין הבסיסי קטעי החומר הלבן (איור 2).

באיור 1. מחט זכוכית בקוטר של 50 מיקרומטר. מרחק בין שתי קרציות קצרבסולם מייצג באורך 50 מיקרומטר.

2. איור Lysolecithin הזרקת כפיס המוח. Demyelination מוצג ביטוי לא חלבון המיאלין הבסיסי (שטח מקווקו). שים לב גודל קטן בדרכי מחט זכוכית (חיצים). בר = 100 מיקרומטר

דיון

שיטה הראו בסרטון הזה הוא מאוד שימושי כדי לספק את רוב סמים או וקטורים ויראליים למקומות מאוד מדויק לתוך המוח. חלק מן היתרונות העיקריים של השיטה הזו הן אמינות של נקודת המיקוד, את הדיוק של זריקות ואת גודל קטן של פגיעה מוחית ולנזק בדרכי ^{1, 2, 5, 6.} לאחר הטכניקה היא סטנדרטית את טווח Mistargeting צריך 50 מיקרומטר או פחות ^{1, 2.} השתלות תאים יכול להעשות גם באמצעות הרחבה, 100-150 מיקרומטר ^7-9, מחטים. מסירה תאים יעיל לכן ניתן להפקיד לתוך ספציפיים מאוד מזעור הנ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צינור זכוכית נימי	Wiretrol I	5-000-1001
חולץ מיקרופיפטה	Kopf Instruments	דגם 730
Microforge	World Precision Instruments, Inc.	דגם 48000
שמן מינרלי	MSDS	M7700
גריז ואקום גבוה	Dow Corning	05054-AB
הרדמה: 2.5% Avertin			2,2,2-tribrom– אלכוהול תנול + טרט-אמיל, 1:1 w/v
כרית חימום	מסטקס	דגם 900
מכשיר סטריאוטקטי	Kopf מכשירים	דגם Kopf-900
להב אזמל כירורגי # 15	Medi-Cut
Micro Driller	אידיאלי מקדחה מיקרו	67-1000
מלקחיים עדינים	כלי
עדינים 1-μ L מיקרופיפטה	Rainin
Parafilm M.
מיקרוסקופ כירורגי	Carl Zeiss, Inc.	Vasiorkop עם מערכת
מיקרו-מזרק	Narishige International	דגם MO-10