האזור כתר לולאה רצפים שונים V3 של גליקופרוטאין את פני השטח המעטפה (gp120) של HIV-1 יכול להיות מאופיין מבנית במקרים רבים על ידי קיפול ב סיליקו תפקידים 10-22 של הלולאה באמצעות המדינה-of-the-art מבראשית מתקפלים אלגוריתם. כאן אנו מדגימים את קיפול והערכה של האזור הזה של הלולאה V3 מהלחץ R2 של HIV-1, זן ייחודי נטרול רגיש עם תכונות תפקודית תמוה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הערכת Dynamic תכונות רלוונטיים Immunologically מבנית השלישון של HIV-1 רצף V3 קראון Loop R2 על ידי מבראשית מתקפל
במאמר זה
סיכום
תקציר
המגוון antigenic של HIV-1 כבר זמן רב מכשול עיצוב חיסון, וזה השתנות בולטת במיוחד לולאה V3 של גליקופרוטאין של הנגיף פני המעטפה. הצענו בעבר כי הכתר של הלולאה V3, למרות רצף משתנה דינמי, מוגבל בכל האוכלוסייה של HIV-1 וירוסים למבנה β-מכבנה רלוונטי immunologically שלישוני. חשוב לציין, יש אלפי רצפים שונים לולאה V3 הכתר במחזור HIV-1 וירוסים, מה שהופך אפיון מבניים 3D של מגמות על פני מגוון של וירוסים קשה או בלתי אפשרי על ידי קריסטלוגרפיה או NMR. מחקרים קודמים מוצלחים שלנו עם מתקפלים של כתר V3 1, 2 ניצלו את אלגוריתם מלכתחילה 3 נגיש את החבילה ICM-Pro תוכנה מולקולרית דוגמנות (Molsoft LLC, La Jolla, CA) והציע את הכתר של הלולאה V3, במיוחד מן עמדות 10-22, הטבות מספיק מהגמישות ואורך נובעת איגוף שלה להתנהג במידה רבה כאילו הוא פפטיד מאולצת בחופשיות מתקפלים בתמיסה. ככזה מתקפלים, ab initio מהיר של חלק זה רק לעניינים V3 של זן כל יחיד של 60,000 + במחזור זני HIV-1 יכול להיות אינפורמטיבי. כאן, אנו קיפל את הלולאה V3 של המתח R2 לקבל תובנות לתוך הבסיס המבני של תכונותיו המיוחדות. R2 נושאת V3 נדיר לולאה רצף חשב להיות אחראי על הרגישות המופלאה של זן זה על ידי נטרול סרה החולה נוגדנים חד שבטיים 4, 5. מתווכת זן CD4 עצמאית זיהום מופיע לעורר נוגדנים מנטרלים רחב. אנו מדגימים כיצד הערכה של תוצאות מתקפלים יכול להיות אינפורמטיבי עבור שיוך מבנים שנצפתה מתקפל עם הפעילויות החיסוניות שנצפו עבור R2.
פרוטוקול
1. מתודולוגיה
- השלב הראשון של הפרוטוקול הוא לבחור את רצף כתר V3 אתה רוצה לקפל סיליקו. עבור המתח R2, רצף של שבר זה KSIPMGPGRAFYT.
- המבנה האטומי 3D של הפפטיד המתאים רצף זה צריך להיות בנוי המרחב הווירטואלי של המחשב. הפקודה ICM לכך היא:
buildpep "KSIPMGPGRAFYT"
או קובץ: חדש: פפטיד ניתן לבחור תחת למשוך למטה בתפריט - מספר פרמטרים של ההליך נקבעים אז, כולל מספר שלבים החיפוש (אורך של החיפוש), הטמפרטורה סימולציה, אסטרטגיה חיפוש פרמטרים כולל המגבלות משתנה הטיה החיפוש לכיוון אזורים סביר, מבחינת אנרגיה, מבחר שיטות חישוב שונות אנרגיה, פרמטרים המעידים כיצד החיפוש תירשם כגון האם להקליט סרט וכמה תצורות ניקוד ביניים צריך להיות מוקלט. כל הפרמטרים האלה מוטבו על ידי פרסומים קודמים (ראה www.molsoft.com).
- קיפול הוא יזם אז עם הפקודה:
Montecarlo
או קובץ: חדש: פפטיד ניתן לבחור תחת למשוך למטה בתפריט מכניקה מולקולרית: מזער: גלובל
במקרה הראשון, הפרמטרים של שלב 3 צריך להיות מוגדר אחד אחד בשורת הפקודה. במקרה האחרון, תיבות עבור הפרמטרים ביותר נבחר בדרך כלל ניתנים בחלונית לפני הפקודה מתבצעת. לנוחיותך, התסריט זהה מתקפלים ICM מנוצל לצורך הניסוי הזה וניסויים שפורסמו בעבר מוצג כאן:
סקריפט זה ניתן לשמור בקובץ טקסט ולהפעיל מלפעול קו של המחשב הפקודה המערכת (בד"כ לינוקס) במהירות באמצעות הפקודה:
ICM _foldingscript
2. סודות להצלחה
- הלולאה V3 הוא קבוע 35 חומצות אמינו בהרחבה כמעט בכל זן ידוע, ולכן העמדות חומצת אמינו ממוספרים 1-35 החל דיסולפיד שמקורם מלוכדות ציסטין ב 1 וסיום עם דיסולפיד המקביל מלוכדות ציסטין ב 35. מאז היא חלק של לולאה, גבולות של הכתר של V3 יש לבחור בקפידה. אם גדול מדי קטע נבחר, אין זה סביר להתנהג כמו קטע גמישה בחופשיות כאילו הוא פפטיד בחינם, אז סימולציה קיפול לא נכון להעריך את המבנה. אם קטן מדי קטע נבחר, מבנה שלישוני אינפורמטיבי לא יכול ליצור בהדמיה. המחקר שלנו הראה כי לפני שבר מעמדה לעמדה 10 22 בקורלציה עם תצורות נוגדנים מחויב קריסטלוגרפיים, אז זה שבר של כל לולאה V3 כי יש לבחור לקיפול.
- למרות תפריטים באמצעות ממשק המשתמש הגרפי ו הנפתח הוא ידידותי למשתמש, העבודה מוצלח קודם על קיפול פפטיד בכלל באמצעות ICM ו V3 לולאה כתר מתקפלים במיוחד המשמש את התסריט הנ"ל, פשוט לשנות את רצף בקו buildpep ולהפעיל את בתסריט לעיל משורת הפקודה מומלץ.
3. נציג תוצאות
תוצאות לקיפול R2 מייצגים את התוצאות עבור כל לולאה V3. כדי להעריך את התוצאות, קובץ הפרוייקט (זה יהיה בשם "newProject1.icb" מהתסריט לעיל) צריך להיות נפתחה "מכניקה מולקולרית, סטאק, תצוגה" נבחר. שולחן של תצורות מחסנית יופיע. תצורות מחסנית ניתן דמיינו גרפית ידי לחיצה על סמל מגרש / היסטוגרמה. "מכניקה מולקולרית, סטאק Play" יהפוך לסרט של מחסנית חזותית להעריך את ההעדפות קונפורמציה שנחשף על ידי קיפול. עבור רצף R2, קונפורמציה הוא בטא מכבנה כמו כצפוי עבור V3 2 לולאות - במיוחד בקטע על עמדות 12-14 שם העדפה ברורה β-גדיל נתפסת בכל מחסנית, ומעטים מאוד סליל אלפא תצורות נתפסים. יתר על כן, פער האנרגיה של כמעט 3 יחידות נתפסת בין הקונפורמציה האנרגיה הנמוכה ביותר ואת קונפורמציה second האנרגיה הנמוכה ביותר. מנקודת המבט האנרגטית, זה אומר כי המבנה רק מהבהב מתוך קונפורמציה האנרגיה הנמוכה ביותר פחות מאחוז אחד של הזמן: את התוצאות מתקפלים ולכן מראים כי V3 R2 כתר היא נוקשה, ולא מבנה גמיש. אולי יש תכונות מבניות נוספות חשוב ההרכב של תצורות, אבל הם קשה להעריך באופן שיטתי.
| JRFL | SF162_V3JRFL | SF162_V3R2 | |
| 447-52 ד GMT 50 | 15 | 0.00061 | 0.00078 |
טבלה 1: נטרול יחסי של JRFL ו R2 V3 לולאות במסגרות רעולי פנים מסיכה. הנתונים דווחה בעבר קרדוזו ט, et al. ARHR (2008) ו - פינטר, A., et. אל ג'יי Virol (2004). בקצרה, בנטרול הפעילות נקבע עם assay מחזור יחיד infectivity באמצעות psVs שנוצר עם env-פגום בלוציפראז-לבטא pNL4-3.Luc.RE-פלסמיד pseudotyped עם Env JRFL או SF162 וריאנטים V3 שתוארו לעיל: SF162_V3JRFL מכיל את JRFL V3 רצף לולאה במקום רצף V3 SF162 לולאה. SF162_V3R2 מכיל את V3 R2 לולאה רצף במקום ברצף V3 SF162 לולאה. PsVs הודגרו עם דילולים הסידורי של מב 447, 52 ד עבור 1.5 שעות ב 37 ° C, ולאחר מכן הוסיף CD4 + CCR5 + U87 תאים היעד מצופה ב 96-היטב צלחות בנוכחות polybrene (10 מ"ג = מ"ל). לאחר 24 שעות, התאים היו refed עם המדיום RPMI המכיל 10% FBS ו 10 מ"ג = מ"ל polybrene, ואחריו שעות נוספות של הדגירה 24-48. פעילות בלוציפראז נקבע postinfection 48-72 שעות עם luminometer צלחת microtiter (HARTA, Inc) באמצעות ריאגנטים assay מ titers Promega, Inc הממוצע הגיאומטרי של נטרול 50% (GMT50) על ידי 447-52 ד נקבעו על ידי אינטרפולציה של עקומות נטרול ו הם ממוצעים של לפחות שלושה מבחני עצמאית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
קיפול מבראשית מגלה תכונות מבניות שלישוני, תופעות אשר לא יכול להיות ברור מלימוד חומצות אמינו בודדות ברצף. כמה מאפיינים מבניים לטשטש בעבר של V3 R2 לולאה הכתר מתגלים על ידי סימולציה המתקפל. אלו העדפות מבניים נצפתה להיות מתואמים עם מאפיינים פונקציונליים הנצפית של המתח R2, כלומר רגישות נטרול ו hyperinfectivity 5.
ראשית, הנטייה ברורה β-גדיל במחצית N-מסוף של הכתר V3 R2 על עמדות 12-14 הוא ציין. זהו המ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
העבודה נתמכה על ידי תרומות של ביל ומלינדה גייטס (# 38631) ו-NIH, כולל OD004631 DP2 ו R01 AI084119.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ICM-Pro | Molsoft LLC |
מקורות
- Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Zolla-Pazner, S. &, Cardozo, T. Dynamic characterization of the V3 loop crown. Antiviral Therapy. 12, 13-31 (2007).
- Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Swetnam, J., Zolla-Pazner, S., Cardozo, T. Structural conservation predominates over sequence variability in the crown of HIV type 1's V3 loop. AIDS Res Hum Retroviruses. 26, (2010).
- Abagyan, R., Totrov, M. Biased probability Monte Carlo conformational searches and electrostatic calculations for peptides and proteins. J Mol Biol. 235, 983-1002 (1994).
- Quinnan, G. V., Zhang, P. F., Fu, D. W., Dong, M., Alter, H. J. Expression and characterization of HIV type 1 envelope protein associated with a broadly reactive neutralizing antibody response. AIDS Res Hum Retroviruses. 15, 561-5670 (1999).
- Zhang, P. F., Bouma, P., Park, E. J. A variable region 3 (V3) mutation determines a global neutralization phenotype and CD4-independent infectivity of a human immunodeficiency virus type 1 envelope associated with a broadly cross-reactive, primary virus-neutralizing antibody response. J Virol. 76, 644-655 (2002).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
