מאמר שיטה

הערכת הפקה חליפין וירוס במערכות Aquatic

13.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/2196

⸱

22 בספטמבר 2010

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, University of Tennessee

במאמר זה

סיכום

שיעור התחלופה של וירוסים במערכות ימיים מים מתוקים ניתן לאמוד על ידי ירידה וטכניקה הישנותם. הנתונים לאפשר לחוקרים להסיק ששיעורי התמותה וירוס בתיווך של חיידקים במערכות מים.

תקציר

וירוסים הם רכיבים של מערכות מתפשט ימיים מים מתוקים, ו ידועים להיות סוכני משמעותי של תמותה של חיידקים. פיתוח אומדנים כמותיים של תהליך זה הוא קריטי כפי שאנו יכולים לפתח מודלים טובים יותר של מבנה הקהילה לתפקד חיידקים, כמו גם לקדם את הבנתנו כיצד וירוסים עובדים לשנות מחזורים biogeochemical מימיים. טכניקת ירידה וירוס מאפשר לחוקרים להעריך את הקצב שבו חלקיקי הנגיף משתחררים מן הקהילה חיידקים אנדמיים. בקיצור, שפע (תאית) וירוסים חינם מצטמצם במדגם בעוד הקהילה חיידקים נשמר ריכוז הסביבה הקרובה. הקהילה מיקרוביאלי הוא מודגרות אז בהיעדר של וירוסים חינם בקצב שבו וירוסים כמוה במדגם (דרך תמוגה של חברי כבר נגוע של הקהילה) ניתן לכמת באמצעות מיקרוסקופיה epifluorescence או, במקרה של וירוסים ספציפיים, כמותי PCR. שיעורים אלה לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להעריך את שיעור התמותה עקב חיידקים תמוגה וירוס בתיווך התא.

פרוטוקול

1. Ultrafiltration של מי ים כדי לייצר "וירוס חינם" מים (וילהלם & Poorvin 2001)

  1. כ 20L של מי ים / lakewater נאסף כמו בסביבה נקייה מחיידקים ככל האפשר.
  2. מים prefiltered סדרתי דרך 142 מ"מ קוטר פוליקרבונט 0.8 מיקרומטר מסננים כי אפשר לשמור על -20 ° C לניתוח הקהילה. מוגדלת גודל מסננים נקבוביות ניתן להשתמש לפני שלב זה עבור מערכות פורה מאוד.
  3. כדי להשיג מים ultrafiltered ממערכת Amicon M12 (Millipore) 30 kDa-הפסקת המחסנית ספירלה משמש לכלול את כל וירוסים, אפילו קטן וירוסים RNA.
  4. הדגימות מעובדים מרוכז במהירות ~ 25% עם 15-16 kPa ~ של backpressure.
  5. המדגם הנותרים של 500 מ"ל מים ~ יכיל הקהילה נגיף מרוכז (אשר ניתן לשמור על ניסויים אחרים), בעוד הנותרים 19.5 ליטר של מים מווירוסים ישמש מבחני ההפקה ויראלי.
  6. אחרי יום אחד של שימוש, המערכת M12 Amicon יש לנקות כדי למנוע נזק הממברנה של מחסנית המסנן.
  7. אם אתה עובד עם מי ים, יש לשטוף את הממברנה עם לפחות 6L מים מילי-Q ואחריו כביסה עם פתרון NaOH 0.1N עבור 30-45 דקות.
  8. שוב לשטוף את המחסנית עם לפחות 6L מים מילי-Q.
  9. בסיום השימוש במערכת M12, מחסנית ספירלה יש לאחסן פתרון 0.05MH 3 4 ת.ד. ב 4 ° C.

2. הפחתת וירוס שיטת הפקה ויראלי (וילהלם et al. 2002)

  1. עד 500 מ"ל של מי ים מדגם / lakewater עם שני מארח ווירוסים מתקבל והניח ביחידה sterifilter עם 0.2-מיקרומטר הנומינלי נקבוביות גודל נמוך חלבון מחייב סינון (למשל, Durapore) הניח על זה.
  2. המדגם בעדינות אבק לחץ על 200 מ"מ כספית <בעוד הרף resuspending המדגם בעזרת פיפטה סטרילית העברת לעכב תאים חיידקיים מן להתרכז המסנן.
  3. לאט לאט שלושת הכרכים של ultrafiltrate מתווספים ההשעיה חיידקי כדי להפחית באופן משמעותי את מספר וירוסים חינם במדגם.
  4. חלק חיידקי הוא מדולל בחזרה 500 מ"ל מים עם וירוסים חינם מחולק לשלושה משכפל של 150 מ"ל כל ממוקמים בקבוקי 250 מ"ל ברור פוליקרבונט.

3. תזרים משיק סינון (TFF) שיטת ייצור ויראלי (Weinbauer et al. 2002, Winget et al. 2005)

TFF מייצג גישה חלופית לשיטת הפחתת ויראלי.

  1. כ 500 מ"ל של המדגם טבעי נאסף כמתואר לעיל.
  2. מדגם זה מרוכזת באמצעות-0.2 מיקרומטר הנומינלי נקבוביות בגודל משיק מערכת סינון לזרום.
  3. כאשר חלק חיידקי מצטמצם בערך 10-15 מ"ל, ultrafiltered, וירוס ללא מים הוא הוסיף ומופץ לעיל.
  4. הבקבוקים לשכפל מודגרת בבית בתנאים באתרו שימוש בתאי הסביבה.
    1. רמות אור משתנים תנאי השטח באמצעות הכחלחלה אקרילי אקריליק או לנקות עם הקרנת נטו לירידה בעוצמת האור.
    2. טמפרטורות פני השטח אמביינט מתקבלים לעתים קרובות באמצעות מי ים זורמים הסיפון חממה.
  5. דוגמאות עבור הערכות שפע חיידקים ווירוסים נלקחים בזמן 0 עם ריכוז סופי של glutaraldehyde סטרילי 2.0-2.5% נוסף לתוך cryovials. דגימות אלה מיד פלאש קפוא עם חנקן נוזלי ומאוחסנים עד קפוא מעובד.
    1. אם חנקן נוזלי אינו זמין, שקופיות מיקרוסקופ עשוי להיות מוכן ומעובד באופן מיידי (ראה נוהל להלן)
  6. Subsamples נאספים כל 2.5 שעות לפחות 10 שעות על ידי השיטה המתוארת לעיל.
    1. באותה מים הפעם עשוי להיאסף לניתוח PCR כמותי. עד 5 מ"ל של המדגם ניתן להוסיף cryovial עם סוכן לא מקבע עם הקפאת פלאש מיידית חנקן נוזלי.

4. הפקה מיקרוסקופית ויראלי (נובל & Fuhrman 1998, ון et al. 2004)

  1. דגימות קפואות להיות 0.02-מיקרומטר סינון עבור מיקרוסקופיה צריך להיות מופשר על הקרח.
  2. הכן פתרון המניות של SYBR הירוק על ידי דילול פתרון 1:10 המניה עם מים סטריליים. בשלב הבא, מפתרון המניות, להכין עבודה על ידי הוספת פתרון 1mL הפתרון המניות של 39 מ"ל מים סטריליים. גליצרול 50%, פוספט 50% שנאגרו פתרונות מלוחים (PBS, 0.05 M Na 2 HPO 4, 0.85% NaCl, pH 7.5) ומלאי טרי פתרון 2.5% phenylenediamine-p צריך גם להיות מוכן לפני תחילת. שמור על 50% glycerol/50% פתרון PBS ב 4 ° C ו-p phenylenediamine המניה ב -20 ° C בחושך עד ההתחלה. ממש לפני הסינון מוסיפים את p-phenylenediamine של 50% PBS glycerol/50% ריכוז סופי של 0.1% כדי לשמש כפתרון Antifade.
  3. מניחים 25 מ"מ 0.02-מיקרומטר לסנן Anodisc על גבי MicronStep 0.45-מיקרומטר, מסנן גיבוי מתאית. הוספת 850 μL המדגם קבוע לחלק העליון של Anodisc ואקום ב PKA 20 עד יבש לחלוטין. 100 מקום μL הפתרון הירוק SYBR הפועלים צלחת פטרי סטרילית, עם הריק עדיין בזהירות להסיר את Anodisc ממגדל מקום לסנן על הירוק SYBR. דגירה דגימות בחושך בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. בזהירות להסיר את המסנן מפתרון SYBR הירוק הפתיל האחורי של המסנן עם Kimwipe כדי להסיר את כל שאריות צבע. אם תרצה, תוכל להחזיר את המסנן למגדל ולהעביר עד 800 μL של מים מסוננים 0.02-מיקרומטר או מדיה סטרילית דרך המסנן כדי לשטוף את הכתם עודף.
  4. הוסף טיפה קטנה של פתרון antifade לשקופית המיקרוסקופ במקום להחליק על גבי העטיפה. הסר את תלוש לכסות ולהוסיף את מסנן יבשים לשקופית מיקרוסקופ רטוב עם פתרון antifade. שוב, להוסיף כמות קטנה של פתרון antifade להחליק את המכסה לאט למקם אותו על גבי המסנן, מוודא להיפטר מכל הבועות כי עלול להיווצר.
  5. מיד להקפיא את השקופיות ב -20 ° C עד הצורך (אלה יש להשתמש תוך כמה חודשים כדי למנוע דהייה והוריד ספירת וירוס)
  6. וירוסים הם המנויים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (במקרה שלנו מיקרוסקופ DMRXA לייקה) עם סט רחב מסנן כחול (אקס λ = 450-490 nm, λ = 510 nm Em עם מסנן דיכוי ב λ = 510 ננומטר). כל מסנן יהיה לפחות 20 שדות הראייה נספר, מוודא לכמת וירוסים סך מרשת כל שדה כדי להבטיח אפילו הפצה של וירוסים דרך הממברנה את המסנן.
  7. שיעור ממוצע של הישנותם וירוס משלושת עצמאית משכפל מחושבים אז סטיית התקן נקבעת שיעורי הייצור.

5. נציג תוצאות

הנתונים הגולמיים שנאספו על ידי החוקר דורש עיבוד מתמטי מינימלי כדי לייצר שיעורי הישנותם של שפע וירוס. קבוצת הנתונים העיקרי הנובע מחקר זה היא שיעורי הישנותם של שפע וירוס ב subsamples מ incubations. תוצאות אלו בצורה עצמאית רגרסיות שפע של זמן לעומת וירוס עבור כל אחת מהדגימות. עבור כל דגימה incubations הפרט לפעול כמו טיפול אחד, אז על ידי השלמת three-לשכפל incubations החוקר יכול לחשב שיעורי כמו גם אומדן של שונות (למשל, סטיית תקן) (ראה איור 1).

אזהרה אחת של תהליך זה היא כי ירידה קבועה שפע וירוס מוביל לירידה בתאי המארח במדגם כי הם שנשאו בנטל וירוס. כדי לקזז את ההפסד הזה, ספירה של שפע חיידקי ממקור שני (מי ים או מים מסוננים האגם) ו T = 0 מדגם הדגירה נחוצים. מידע זה יכול לשמש כדי להסביר את האחוז של תאים שאבדו: בהנחה כי תהליך הפחתת שפע וירוס אינה סלקטיבית בעד או נגד כל חברי הקהילה חיידקים, גורם זה יכול לשמש כדי לאמוד את קצב הפקת באתרו של וירוסים .

איור 1
באיור 1. הייצור של דגימות נגיף דמוי חלקיקים מעל הדגירה של 10 שעות בבית בתנאים באתרו באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence. נאספו במהלך הפיטופלנקטון פריחה לחופי ניו זילנד בספטמבר 2008.

איור 2
איור 2. תרשים סכמטי של תהליך זרימת עבודה עבור ייצור assaying וירוס. התהליך מתחיל עם ultrafiltration המים מדגם ליצור וירוס ללא מים. זהו השלימה באמצעות מערכת ultrafiltration. בדגימות מים במקביל נאספים מאותו אתר ואת וירוסים חינם עברו דרך פילטר בעוד הקהילה חיידקים (המכיל תערובת של תאים נגועים ולא נגועים) נשמרת. קהילה זו היא resuspended אז במים וירוס בחינם מודגרות תחת בתנאים באתרה. שיעור הישנות של וירוסים מנוטר אז במשך 10 השעות הבאות כדי לקבוע שיעורי הייצור וירוס.

דיון

מרכיב קריטי להבנת אופן השפעת וירוסים הקהילות חיידקים ימיים היא לקבוע את הקצב שבו חלקיק הנגיף מיוצרים. בהתחשב בכך שכיחותם הם (פחות או יותר) סטטי ברוב מערכות (וילהלם & Suttle 1999, Weinbauer 2004), כי וירוסים יוסרו או שניתנו לא זיהומיות במהירות במערכות מים (וילהלם et al. 1998), אז שיעורי הייצור חייב להיות יחסית מהירה כדי להחליף את חלקיקי לאיבוד.

אמידת וירוסים התמותה לגרום לקהילה חיידקים דורש ידע של איך וירוסים רבים מיוצרים בכל פעם וירוס lyses תא (להלן: "גודל פרץ"). פרץ וירוס בגדלים בדגימות טבעי יכול להשתנות במידה רבה. גדלים Burst ניתן לקבוע באופן ישיר על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים (למשל, Weinbauer & Peduzzi 1994), אבל זה בדרך כלל מעבר ליכולות של מעבדה מסוימת או לא תמיד מעשי. במצבים בהם לא ניתן לקבוע באופן אמפירי, ערכים בספרות של 24 וירוסים לכל אירוע ממס ניתן להשתמש במערכות ימית 34 עבור מערכות מים מתוקים (Parada et al. 2006). אם קצב הייצור וירוס מחולק במספר הזה, התוצאה היא שפע של תאים לכל נפח נהרס על ידי וירוסים על בסיס יומי. חיידקים lysed ערך אז יכול להיות מחולק המניה עומד שפע חיידקים וכתוצאה מכך התמותה הנגרמת וירוס למערכת הנדון: קיימות ההערכות נעות בין אחוזים בודדים לאוכלוסייה כמעט כולו, ולעתים קרובות הם תלויים בגורמים אחרים במערכת הנדונה (וילהלם & Matteson 2008). כדי לקבוע את שיעור התמותה הכולל מספר זה מוכפל לעתים קרובות על ידי שני (עבודה מתוך ההנחה כי 50% מכלל התאים ממשיכים להתרבות ו 50% של התאים אבדו, Weinbauer 2004).

בהתחשב בכך הזמינות הביולוגית אלמנט מזין עקבות (למשל, N, P, Fe) יכול להגביל את שיעור הפריון העיקרית, וכן שטף הפחמן כאלה, דרך מערכות מים, והבנה של תפקיד התמותה מונחה וירוס חיידקים בתהליך הזה הפך לעניין geochemists ימיים. כיום קיימות מספר הערכות כי וירוסים מציע לשחרר ריכוזים משמעותיים של אלמנטים מזין בחזרה בעמודת המים על בסיס יומי (רו et al. 2008, היגינס et al. 2009) וכי מרכיבים אלה נטמעו במהירות על ידי הקהילה חיידקים (Poorvin et אל. 2004, Mioni et al. 2005). שיעור השטף מזין לסביבה ניתן לקבוע על ידי הכפלת מספר התאים נהרסו על ידי בסכום של התא לכל מזין (מסומן "מכסות"). מידע זה יכול לספק מרכיב קריטי להבנת איך קורי מזון מיקרוביאלי לתפקד על פני מערכות מימיים.

התפתחויות שוטף: מאמצים שוטפים על ידי שורה של קבוצות מחקר כרוך בהתאמת האסטרטגיה לעיל למנות וירוסים ספציפיים בתוך הקהילה, וככזה, כדי לקבוע כיצד אורגניזמים מסוימים מושפעים פעילות הנגיף. כדי לעשות זאת החוקרים להשתמש פולימראז כמותיים תגובת שרשרת (qPCR) כדי להעריך את השפע של קבוצות וירוסים ספציפיים או משפחות במקביל האומדנים של הקהילה הכולל וירוס. התוצאות לאחר מכן ליישם ישירות לספק הערכות של תמותה וירוס, מחזור מזין, וכו 'עבור קבוצות ספציפיות פלנקטון. גישה חדשה זו עוצמה יאפשר לחוקרים בשנים הקרובות לחפור הרבה יותר עמוק לתוך התהליכים הקשורים באקולוגיה של וירוסים, בפעם הראשונה, לכמת את יחסי הגומלין של וירוסים לארח קהילות ספציפיות מעבר לאילוצים של מערכות מעבדה.

גילויים

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תודות

הפרסום של מאמר זה היה נתמך על ידי מענק מטעם משרד המחקר של אוניברסיטת טנסי. המחברים מודים הדור הקודם של סטודנטים וחוקרים אשר עבדו כדי לחדד נהלים אלה. המחקר נתמך על ידי מענקי הקרן הלאומית למדע (NSF-0851113, 0825405 ו - NSF-NSF-0550485).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2.5% p-phenylenediamineAcros Organics130575000מלאי עבור Antifade
מערכת Amicon Proflux M12EMD MilliporeN/Aניתן להשתמש בכל מכשיר אולטרה-פילטרציה לשלב זה
צבע ג'ל לחומצות גרעין SYBR Green IInvitrogenS-7563
מסנן Helicon S10 30kDaEMD MilliporeCDUF010LT
מסנני Pelicon XL 0.22 μmFisher ScientificPXGVPPC50
מסנני ממברנת PCTE של GE 0.2 μm (47mm)Fisher Scientific09-732-35
מערכת סינון זרימה טנגנציאלית (TFF) בקנה מידה מעבדתי של MilliporeEMD MilliporeXX42LSS11ניתן להשתמש במערכות TFF אחרות לשלב זה
מסננים לבנים חלקים, תאיתיים, Micronstep 0.45 μm (25mm)Fisher ScientificE04WP02500
מסנני Anodisc של GE Whatman 0.02 μm (25mm)Fisher Scientific68-09-6002
מיקרוסקופ Leica DMRXAניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנציה עם סט מסננים כחולים
מכלי פוליקרבונט 20LFisher Scientific
גליצריןFisher ScientificBP229-4
PBS (0.05 M Na2HPO4, 0.85% NaCl, pH 7.5)Fisher ScientificBP329-500, S640-500
50% גלוטראלדהידFisher ScientificG151-1
מבחנות קריו-פוליפרופילן עם הברגה חיצונית של Corning, 2 mLFisher Scientific09-761-71ניתן להשתמש בכל מבחנות קריו
מבחנות קריו-פוליפרופילן עם הברגה חיצונית של Corning, 5 mLFisher Scientific09-761-74ניתן להשתמש בכל מבחנות קריו
85% H3PO4Fisher ScientificA242-212אחסון ממברנה ספירלית
גרגירי NaOHFisher ScientificS318-3ניקוי M12
משאלי מדידה
מסנן ממברנת Isopore בגודל נקבים 0.8-μm (142mm)EMD MilliporeATTP14250
תושבת מסנן לחץ מפלדת אל-חלד של Millipore (142mm)Fisher ScientificYY30 090 00

מקורות

  1. Higgins, J. L., Kudo, I., Nishioka, J., Tsuda, A., Wilhelm, S. W. The response of the virus community to a mesoscale iron fertilization in the sub-Arctic Pacific Ocean. Deep-Sea Res II. 56, 2788-2795 (2009).
  2. Mioni, C. E., Poorvin, L., Wilhelm, S. W. Virus and siderophore-mediated transfer of available Fe between heterotrophic bacteria: characterization using a Fe-specific bioreporter. Aquat Microb Ecol. 41, 233-245 (2005).
  3. Noble, R. T., Fuhrman, J. A. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
  4. Parada, V., Herndl, G., Weinbauer, M. G. Viral burst size of heterotrophic prokaryotes in aquatic systems. J Mar Biol Assoc U K. 86, 613-621 (2006).
  5. Poorvin, L., Rinta-Kanto, J. M., Hutchins, D. A., Wilhelm, S. W. Viral release of Fe and its bioavailability to marine plankton. Limnol Oceanogr. 49, 1734-1741 Forthcoming.
  6. Rowe, J. M., Saxton, M. A., Cottrell, M. T., DeBruyn, J. M., Berg, G. M., Kirchman, D. L., Hutchins, D. A., Wilhelm, S. W. Constraints on virus production in the Sargasso Sea and North Atlantic. Aquat Microb Ecol. 52, 233-244 (2008).
  7. Weinbauer, M. G. Ecology of prokaryotic viruses. FEMS Microbiol Rev. 28, 127-181 (2004).
  8. Weinbauer, M. G., Peduzzi, P. Frequency, size and distribution of bacteriophages in different marine morphotypes. Mar Ecol Prog Ser. 108, 11-20 (1994).
  9. Weinbauer, M. G., Winter, C., Hö, fle, G, M. Reconsidering transmission electron microscopy based estimates of viral infection of bacterioplankton using conversion factors derived from natural communities. Aquat Microb Ecol. 27, 103-110 (2002).
  10. Wen, K., Ortmann, A. C., Suttle, C. A. Accurate estimation of viral abundance by epifluorescence microscopy. Appl Environ Microbiol. 70, 3862-3867 (2004).
  11. Wilhelm, S. W., Brigden, S. M., Suttle, C. A. A dilution technique for the direct measurement of viral production: a comparison in stratified and tidally mixed coastal waters. Microb Ecol. 43, 168-173 (2002).
  12. Wilhelm, S. W., Matteson, A. R. Freshwater and marine virioplankton: a brief overview of commonalities and differences. Freshw Biol. 53, 1076-1089 (2008).
  13. Wilhelm, S. W., Poorvin, L. Quantification of algal viruses in marine samples. Paul, J. H. , Academic Press. London, UK. 53-66 (2001).
  14. Wilhelm, S. W., Suttle, C. A. Viruses and nutrient cycles in the sea. Bioscience. 49, 781-788 (1999).
  15. Wilhelm, S. W., Weinbauer, M. G., Suttle, C. A., Jeffrey, W. H. The role of sunlight in the removal and repair of viruses in the sea. Limnol Oceanogr. 43, 586-592 (1998).
  16. Winget, D. M., Williamson, K. E., Helton, R. R., Wommack, K. E. Tangential flow diafiltration: an improved technique for estimation of virioplankton production. Aquat Microb Ecol. 41, 221-232 (2005).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PCR

מאמרים קשורים