זיהוי מטרות מיקרוביאלי של חסינות אדפטיבית במחלות אידיופטית ניתן להשיג על ידי שימוש assay האנזים צמוד immunospot.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): כימות Th-1 תגובות חיסוניות נגד אנטיגנים נייד מיקרוביאלית
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
חסינות מסתגלת היא מרכיב חשוב אישור של פתוגנים תאיים. היכולת לזהות ולכמת התגובות הללו בבני אדם הוא כלי אבחוני חשוב. Assay enzyme-linked immunospot (ELISPOT) הוא צובר פופולריות ביכולתה לזהות התגובה החיסונית התאית נגד אנטיגנים של חיידקים, כולל אוכלוסיות immunosuppressed כגון אלה עם HIV, השתלה, ואת השימוש בסטרואידים. Assay זה יש את היכולת לכמת את התגובה החיסונית נגד אנטיגנים ספציפיים של חיידקים, כמו גם להבחין אם התגובות האלה Th1 או Th2 אופי. ELISPOT אינה מוגבלת לאתר של דלקת. זה צדדי ביכולתה להעריך את התגובה החיסונית בתוך דם היקפיים, כמו גם אתרים של מעורבות פעילה כגון שטיפה ברונכואלוואולרית, נוזל השדרה מוחין, מיימת. זיהוי של המערכת החיסונית כנגד אנטיגנים בודדות או מרובות אפשרי, כמו גם epitopes חלבונים ספציפיים בתוך חיידקים. Assay זה מאפשר זיהוי של המערכת החיסונית לאורך זמן, כמו גם הבחנות מוכר על ידי אנטיגנים לתאי T הפונדקאי. Dual ELISPOT מבחני צבע זמינים עבור גילוי של ביטוי סימולטני של שני ציטוקינים. יישומים אחרונים של טכניקה זו כוללים אבחנה של שחפת extrapulmonary, כמו גם חקירה של התרומה של אנטיגנים זיהומיות למחלות אוטואימוניות.
פרוטוקול
בשביל הפרוטוקול הבא, אנו משתמשים בתאי דם היקפיים mononuclear (PBMC) כמו התאים של עניין. עם זאת, פרוטוקול זה ניתן להשתמש עם סוגי תאים אחרים. בצע את assay במנדף רקמות התרבות באמצעות טכניקה סטרילית.
יום 1: הכנת צלחת תאים
- קחו את הצלחת ELISPOT ופתח אותו למכסה המנוע.
- לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם 150 μL של 1X PBS באמצעות pipettor רב, אם ניתן, גם pipetting יחיד אחרת מקובל.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Assay ELISPOT התפתחה כאחד מבחני החשוב ביותר בשימוש נרחב כדי לפקח על המערכת החיסונית בבני אדם וכן מגוון של מינים אחרים. עם assay ELISPOT, תדרים תא החיסון ניתן למדוד ברמת תא בודד ללא הרחבה או מניפולציה של אוכלוסיות תאים. Assay ELISPOT הוחל נרחב לחקור ספציפית אנטיגן התגובה החיסונית במחלות שונות, כולל זיהומים, סרטן, אלרגיות ומחלות אוטואימוניות. היישום של assay זה יושם בעיקר במחקרים בהם כימות של אנטיגן ספציפי לתאים הוא קריטי או השוואה של התגובה החיסונית לאנטיגן ספציפי במדינות מחלה שוני.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
נתמך בחלקו על ידי מענק ונדרבילט CTSA 1 UL1 RR024975 של המרכז הלאומי למשאבי מחקר, המכונים הלאומיים לבריאות. עבודה זו מומנה על ידי NIH R01 HL 83839; R01 AI 65744.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
א הכנת מדיה
ב הכנת מאגר טריס
- מוסיפים 800 מ"ל של DDH 2 O ל L 1 כוס.
- מדוד 12 גרם של טריס ומוסיפים כוס.
- הוסף hexahydrate 0.12 גרם של מגנזיום כלוריד (MgCl 2: 6 שעות 2 O) לתוך כוס.
- מערבבים עם מוט בחישה מגנטי על צלחת ערבוב אוטומטי.
- לאחר מומס, pH 9.5 הפתרון.
- מוסיפים 200 מ"ל של DDH 2 O ל כוס, מביאים אותו עד 1000mL.
- סנן את הפתרון עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
ג חומרים הדרושים לניתוח ELISPOT:
מקורות
- Dosanjh, D. P., Hinks, T. S., Innes, J. A., Deeks, J. J., Pasvol, G., Hackforth, S., Varia, H., Millington, K. A., Gunatheesan, R., Guyot-Revol, V., Lalvani, A. Improved diagnostic evaluation of suspected tuberculosis. Ann Intern Med. 148, 325-336 (2008).
- Sung, H. K. E.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
