Method Article

סינפסות כימות: Assay Immunocytochemistry מבוססי לכמת מספר סינפסה

DOI:

10.3791/2270

⸱

November 16th, 2010

 , 
1Department of Neurobiology, Duke University, 2Department of Cell Biology, Duke University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט כיצד לכמת את מספר הסינפסות הן בתרבות העצבית הפרידו בסעיפים המוח באמצעות immunocytochemistry. שימוש ספציפי תא נוגדנים, אנו תווית מסופי presynaptic כמו גם באתרים של התמחות postsynaptic. אנו מגדירים סינפסות כנקודות של colocalization בין האותות שנוצר על ידי סמנים אלה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אחת המטרות החשובות ביותר בחקר המוח היא להבין את הרמזים מולקולרית להורות כי בשלבים המוקדמים של היווצרות הסינפסה. ככזה זה הפך להיות הכרחי לפתח גישות אובייקטיבי לכמת שינויים קישוריות סינפטי. החל מ קיבעון המדגם, זה פרטים פרוטוקול איך לכמת את מספר הסינפסות הן בתרבות העצבית הפרידו בסעיפים המוח באמצעות immunocytochemistry. שימוש ספציפי תא נוגדנים, אנו תווית מסופי presynaptic כמו גם באתרים של התמחות postsynaptic. אנו מגדירים סינפסות כנקודות של colocalization בין האותות שנוצר על ידי סמנים אלה. מספר colocalizations אלה היא לכמת באמצעות תקע Puncta Analyzer (שנכתב על ידי Bary ווארק, זמין על פי דרישה, cellbio.duke.edu c.eroglu @) תחת פלטפורמת תוכנה לניתוח ImageJ. Assay סינפסה המתואר פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל הכנה או רקמה עצבית תרבות שעבורו יש לך סמנים טרום postsynaptic סלקטיבית. זה assay הסינפסה היא כלי רב ערך אשר יכול להיות מנוצל באופן נרחב במחקר של התפתחות הסינפטי.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פתרונות להכין:

  1. נוגדן חוצץ:
    • 150 mM NaCl
    • 50 מ"מ טריס-Base (פישר, החתול לא:. BP152-5, 50 מ"מ) - 1.21 גרם
    • 1% BSA (Sigma, חתול לא:. A2153, 1%) - 2.0 גרם
    • 100 מ"מ L-ליזין (Sigma, חתול לא:. L-1137, 100 מ"מ) - 3.65 גרם
    • התאם ל-pH 7.4

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Assay סינפסה שתוארו לעיל מבוסס בהקשר של מטרות הניסוי שלנו, שבו אנו מתמקדים בעיקר על תחזיות מעוררות של RGCs, לא מטוהרים תרבות או בחלק המוח. סיפקנו שולחן התייחסות לרישום נוגדנים פועלות היטב עבור תיוג סינפסות מעוררות (טבלה 1).

Assay זה סינפסה ניתן להתאים לכמת מספר סינפסה האוכלוסייה כל הנוירונים או תת סינפטיים אחרים שבהם קיים סמן טרום postsynaptic סלקטיבית. לדוגמה, assay סינפסה המתואר כאן ניתן להחיל ללמוד סינפסות GAB.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במעבדה של בן א בארס (אוניברסיטת סטנפורד).: Puncta Plug-in עבור תמונה J נכתב על ידי בארי ווארק (ייעוץ Physion הכתובת הנוכחית) Analyzer

מימון;

  • אלפרד פ 'סלואן קרן
  • אסתר א ויוסף Klingenstein קרן, Inc
  • רחבה מחקר ביו קרן
  • תרופה יוזמת מחלת הנטינגטון s
....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
אנטיגן מין חד שבטיים / polyclonal מוכר מספר קטלוגי מהילה יצירות תרבות העבודות בסעיפים
Presynaptic Synapsin ארנב Polyclonal Synaptic מערכות 106004 1:750 Y ND
Synapsin עכבר חד שבטיים Synaptic מערכות 106001 1:500 Y Y
בסון עכבר חד שבטיים Assay עיצובים VAM-PS003F 1:500 Y Y
בסון קביה Polyclonal Synaptic מערכות 141004 1:1000 Y ND
Synaptotagmin 1 ארנב Polyclonal Synaptic מערכות 105002 1:750 Y N
Synaptobrevin 2
(C1.69.1) 		עכבר חד שבטיים Synaptic מערכות 104211 1:500 Y Y
Synaptophysin
(C1.7.2) 		עכבר חד שבטיים Synaptic מערכות 101011 1:500 Y Y
VGlut1 עכבר חד שבטיים Millipore MAB5502 1:2500 N Y
VGlut1 קביה Polyclonal Millipore AB5905 1:2500 N Y
VGlut2 קביה Polyclonal Millipore AB2251 1:2500 N Y
Postsynaptic PSD-95
(6G6 1C9-clone) 		עכבר חד שבטיים זיקה ביו ריאגנטים MA1-045 1:750 Y N
PSD-95 ארנב Polyclonal Zymed 51-6900 1:500 N Y
הומר עכבר חד שבטיים Synaptic מערכות 160011 1:500 Y ND
הומר עכברוש Polyclonal Millipore AB5875 1:500 Y Y
Gephyrin ארנב Polyclonal Synaptic מערכות 147003 1:500 Y Y
Gephyrin עכבר חד שבטיים Synaptic מערכות 147 1:200 Y Y

טבלה 1: רשימת דוגמאות של סמנים טרום postsynaptic טוב שיש לנו מנוצל בהצלחה assay סינפסה שלנו. שימו לב כי זו אינה רשימה ממצה של כל סמנים זמינים. Y = כן, N = לא, ND = לא נקבע.

מגיב חברה חתול. לא.
PBS Invitrogen 20012-027
poly-d-ליזין סיגמא P6407
Laminin Cultrex 3400-010-01
טריטון X-100 Roche Diagnostics GmbH 9002-93-1
עיזים רגיל סרום Gibco 16210
VectaShield עם DAPI וקטור מעבדות H-1200
אוקטובר רקמות-Tek 4583
טריס-Base (50 מ"מ) דיג BP152-5
שור סרום אלבומין סיגמא A2153
L-ליזין סיגמא L-1137
16% PFA פתרון מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים 15711
גרעיניים PFA מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים 19210
24 גם תרבות צלחת בז 35-3047
אנטי עכבר עיזים אלקסה נוגדנים מצומדות Invitrogen ---
אספקה חברה חתול. לא.
12mm, מס '0 זכוכית coverslips קרל הכט GmbH 1105209
מס '1.5 זכוכית coverslip (עבור פרוסות) VWR מדעי 48393241
שקופיות הזכוכית VWR מדעי 48311-703

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
  2. Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Synapse QuantificationImmunocytochemistry AssayPuncta AnalyzerImageJ AnalysisColocalization DetectionPre and Postsynaptic MarkersFluorescence MicroscopyConfocal MicroscopyNeuronal CultureBrain Sections

Related Articles