העברה ויראלית ממוקדת לנוירונים קורטיקו-ספינליים בחולדה יילודים כדי לחקור פגיעה בחוט השדרה

תקציר

מקור: Smit, R. D., et al. התמקדות בדרכי הקורטיקו-ספינל בחולדות יילודים עם וקטור ויראלי כפול באמצעות ניתוחי מוח ועמוד שדרה משולבים. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים את המסירה הממוקדת של וקטורים נגיפיים לנוירונים קורטיקו-ספינליים בחולדה שזה עתה נולדה. הפרוטוקול מאפשר ביטוי גנים מדויק באמצעות הזרקות נגיפיות אנטרוגרדיות ורטרוגרדיות, מה שמקל על מחקר על התחדשות עצבית ופלסטיות לאחר פגיעה בחוט השדרה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. זריקות ישירות לחוט השדרה המכוונות למסופי אקסון

1. בעזרת קצה מחט הזרקת הזכוכית, העריכו את קו האמצע של חוט השדרה על ידי זיהוי עורק עמוד השדרה. עם זאת, אם עורק עמוד השדרה נמצא מחוץ למרכז באופן ניכר או סוטה בדרך כלשהי, העריכו את קו האמצע על ידי שימוש במיקום התהליך הקוצני C2 ואקסטרפולציה לאורך עמוד השדרה.
   הערה: טען את הנגיף לתוך המזרק על ידי פיפטינג ~5 מיקרוליטר על פיסת פרפילם, ומקם את המחט כך שהקצה מונח על טיפת הנגיף.
2. לאחר הזיהוי, מקם את המחט ממש מאחורי למינה C5 בקו האמצע המשוער והשתמש בה כנקודת הייחוס. לאחר מכן, בעזרת המיקרומניפולטור, הזז את המחט לרוחב ימינה ב-0.3 מ"מ. הורד את המחט עד שהיא פשוט נוגעת במשטח חוט השדרה; מעומק זה, צללו את המחט 0.6 מ"מ לחוט השדרה. במידת הצורך, המשך לצלול את המחט עד שהיא מנקבת את חוט השדרה; לאחר מכן, משוך או הורד את המחט לעומק המתאים.
3. יש להזריק 1 מיקרוליטר של וירוס רטרו הקשור לאדנו2-scCre ב-250 ננוטר/דקה. לאחר השלמת ההזרקה, המתן 2 דקות עד שהנגיף יתפזר לחוט השדרה לפני שתמשוך לאט את המחט. חזור על הזריקות באמצעות אותן קואורדינטות רוחביות ועומק בשני אתרים נוספים בתוך חלון עמוד השדרה, אחד בנקודת האמצע והאחרון ממש לפני למינה T1.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Flexible Needle Attachment	World Precision Instruments	MF34G-5	לניקוי מחטי זכוכית והעמסת שמן אדום לתוך מחטי זכוכית.
צינורות נימי זכוכית	World Precision Instruments	4878	למחטי זכוכית משוכות - יש לתכנן עבור מזרקי ננו-ליטר.
מיקרומניפולטור עם סולם Vernier	Kanetec	N/A	למיקוד מדויק במהלך הניתוח.
מכשיר סטריאוטקסי סטנדרטי במעבדה		51600	כדי להחזיק את מחזיק הסטרוטקסיקה של היילוד במקומו
תקן מעבדה עם מתאם עכבר ויילודים	51615	לקיבוע גולגולת יילודים במהלך ניתוח גולגולת והזרקות עמוד השדרה
מיקרוסקופ עם אור וקשקש ורניר Ocular	Leitz Wetzlar	N/A	משמש להדמיה ומדידה של שיפוע של צינורות נימי זכוכית נמשכים לתוך מחטי זכוכית פונקציונליות.
בקר משאבת MicroSyringe	World Precision Instruments	62403	לשליטה בקצב ההזרקה.
Nanoliter 2000 מזרק ראש משאבה	World Precision Instruments	500150	לטעינה והזרקת וירוס בצורה מבוקרת.
pAAV-CMV-scCre	Wu lab		Cre פלסמיד
pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (פלסמיד #44361)	המעבדה של בריאן רות' באמצעות Addgene		DREADD פלסמיד
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	לשימוש עם מזרקי 1 מ"ל ו-10 מ"ל כדי לאפשר הזרקה של הדגם החי.
מלקחיים לשן חולדה	Roboz	RS-5152	לאחיזה בתהליכים קוצניים.
תאגיד הבריאות בקסטר	סטרילי	281324	לשימוש בניקוי דם ולהחלפת נוזלים לאחר ניתוח.
כפפות כירורגיות	N/A	N/A	לשימוש על ידי המנתח לשמירה על שדה סטרילי במהלך הניתוח.
כרית חימום כירורגית	N/A	N/A	לשמירה על טמפרטורת הגוף של דגם החיה במהלך הניתוח.
מיקרוסקופ כירורגי	N/A	N/A	להדמיה משופרת של הפצע הניתוחי.