השתלת בדיקה גמישה תואמת ביולוגית במודל עכבר גליובלסטומה

תקציר

מקור: Lefevre, M. C., et al., Flexible Organic Electronic Devices for Pulsed Electric Field Therapy of Glioblastoma. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים את ההשתלה של בדיקה גמישה ותואמת ביולוגית במודל עכבר גליובלסטומה כדי לספק טיפול ממוקד בשדה חשמלי פועם ליישומים נוירותרפיוטיים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. מודל in vivo
   הערה: עכברי AMU-Neuroinflam פלואורסצנטיים צבעוניים בוגרים (B6. נעשה שימוש ב-Cg-Tg(Thy1-CFP)23Jrs(Ly6a-EGFP)G5Dzk(Itgax-EYFP)1Mnz/FD); עכברים אלה מציגים תיוג של תת-אוכלוסייה של נוירונים Thy1⁺ על ידי ביטוי טרנסגני של ECFP, תיוג של תאים דלקתיים היקפיים LyzM⁺ על ידי ביטוי טרנסגני של EGFP ותיוג של תת-סוג של מיקרוגליה המבטא EYFP בשליטת Cd11c⁺. בקצרה, בעלי החיים מורדמים קלות עם 1.5% איזופלורן למשך 2 דקות לפני כל טיפול או הזרקה. לפני הניתוח מרדימים את בעלי החיים בקטמין (120 מ"ג/ק"ג; IP) וקסילזין (12 מ"ג/ק"ג; IP). לאחר מכן, ג'ל לידוקאין 3% מוחל באופן מקומי כדי להקל על כל כאב באוזניים הקשור לקיבוע התמיכה הסטריאוטקטית. לאחר מכן, תמיסת בופיבקאין 0.25% ניתנת לאתר הניתוח כדי להקל על כל כאב עקב הגולגולת. לאחר הכנת העכבר לניתוח, בוצעה כריתת גולגולת בקוטר 4 מ"מ. בעזרת מחט 26 גרם, נוצר חור בדורה מאטר באמצע הגולגולת, וספרואיד הגידול הוזרק עם מערכת ההזרקה. בנוסף, כפי שמתואר כאן, אלקטרודה גמישה הונחה על ה-GCamp6 או DsRed המבטאת את ספרואיד הגידול לפני איטום הגולגולת בחלון זכוכית.
   1. הניחו טיפה של מי מלח עם חוצץ פוספט (DPBS) של Dulbecco כך שיכסה את הגולגולת. הנח את האלקטרודה הגמישה על טיפת DPBS, והנח בעדינות את החלק האחורי של הגשושית עם רפידות מגע על גב העכבר (איור 1B).
      הערה: השתמש בכפפות סטריליות ובטכניקת "קצה בלבד". החלף את הכפפות אם נוצר מגע עם משטח לא סטרילי. ספק תמיכה תרמית במהלך הליך זה.
   2. גע בטיפת DPBS עם פיסת נייר קטנה כדי לספוג DPBS עד שהגשושית יכולה לשכב שטוחה על הדורה ולעקוב אחר עקמומיות המוח. ודא ששכבה קטנה של DPBS נשארת מתחת לאלקטרודות מבלי לברוח מהצד של האלקטרודה. זה מבטיח מחסום מפני זליגת דבק במהלך השלבים הבאים.
      הערה: עקר את כל הציוד לפני השימוש.
   3. הניחו טיפה קטנה של דבק סיליקון על הגשושית וכסו אותה בזכוכית כיסוי עגולה של 5 מ"מ. דחוף את זכוכית הכיסוי כלפי מטה עד שהסיליקון מתפזר באופן שווה והמרחק בין זכוכית הכיסוי לבדיקה הוא מינימלי. דחוף את זכוכית הכיסוי כלפי מטה למשך 30 שניות נוספות כדי שהסיליקון יוכל להתמצק.
   4. כדי לאבטח את זכוכית הכיסוי, יש למרוח במהירות דבק-על על דפנותיה ולדחוף אותה כלפי מטה עד שהדבק מתרפא למוצק.
   5. בעזרת קיסם יש למרוח דבק-על צוואר הגשושית, תוך הקפדה על שדבק-העל יימשך מתחת לצוואר כדי לספק לו תמיכה יציבה.
   6. מכסים את הגולגולת במלט דנטלי לבניית כובע כרוני. הקפד במיוחד לכסות את שולי זכוכית הכיסוי בלבד.
   7. הרם את החלק האחורי של הגשושית ומרח מלט מתחת לצווארו. הנח את הגשושית על המלט לפני שהיא מתרפאת. דחף בעדינות כלפי מטה את צוואר הגשושית בעזרת מלקחיים קהים כך שפני השטח שלה יהיו באותה רמה כמו זו של זכוכית הכיסוי ולא בדרך של מטרת המיקרוסקופ במהלך הניסוי.
   8. כסו את החלק העליון של צוואר הבדיקה בלא יותר מ-1.5 מ"מ של שכבת מלט דנטלי כדי להשיג אחיזה איתנה בבדיקה. בנו באר בטון המציגה רכס של 1.5 מ"מ במרחק של 1-2 מ"מ סביב זכוכית הכיסוי כדי ליצור אגן עבור נוזל הטבילה עבור הדמיית שני הפוטונים (איור 1C).
   9. לאחר שהמלט נרפא, יש למרוח משככי כאבים בופרנורפין לאחר הניתוח (0.05 מ"ג/ק"ג, 0.1 מ"ל לכל 10 גרם משקל גוף תת עורי) ולשמור על החיה באווירה חמה עד שתתעורר. זה כולל קרבה לנורת אינפרא אדום וכן לעטוף את החיה במגבת נייר.
      הערה: הנח מדחום בגובה העכבר כדי לפקח על הטמפרטורה.
   10. אפיין עכבה בתחום של 1-10 קילו-הרץ באמצעות פוטנציוסטט.
   11. תן לבעל החיים להתאושש מהניתוח למשך 10 ימים לפחות. יש לתת תרופות אנטי דלקתיות מיד לאחר הניתוח ולהמשיך לעקוב אחר מצב החיה כדי לספק משככי כאבים מתאימים לאחר הניתוח.

תוצאות

איור 1: היישום in vivo. (A) תוכנית לניסויים in vivo. (ב) מיקום בדיקה לפני מריחת זכוכית כיסוי ושרף אקרילי. (ג) השתלת בדיקה הושלמה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שרף אקרילי	Fischer Scientific	NC1455685
Buprenorphine	Axience
Lab עשה מחולל
פניצילין / Streptomycin	Gibco	15140-122
תמיסת מלח מאגר פוספט	Thermofisher	D8537
Protolaser S	LPKF
זכוכית כיסוי עגולה בקוטר 5 מ"מ	Fischer scientific	50-949-439
דבק סיליקון Kwik-Sil	World Precision Instruments
סופר דבק	אופיס מחסן
U87-MG	ATCC	HTB-14	תאי גליובלסטומה אנושיים

דופק