גירוי מוחי עמוק כטיפול בהתמכרות לסמים במודל חולדה

תקציר

מקור: Batra, V., et al. שיטה כללית להערכת השפעות גירוי מוחי עמוק על מתן עצמי של מתאמפטמין תוך ורידי. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מדגים מודל של עכברוש של התמכרות לסמים שבו בעל החיים נותן בעצמו מתאמפטמין תוך ורידי על ידי לחיצה על מנוף, מה שמוביל להתנהגות כפייתית של חיפוש סמים המונעת על ידי שחרור דופמין בגרעין האקומבנס. כדי לנטרל זאת, החולדה עוברת גירוי מוחי עמוק (DBS) באמצעות אלקטרודה דו-קוטבית מושתלת, המספקת פולסים בתדר גבוה כדי לעכב נוירונים היפראקטיביים בגרעין האקומבנס. לאחר מכן מעריכים את ההשפעות של DBS על ידי התבוננות בשינויים בהתנהגות חיפוש סמים, וחושפים את הפוטנציאל שלו להפחית תגובות הקשורות להתמכרות.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. התאקלמות מכרסמים והגבלת מזון

1. השתמש בחולדות Wistar בוגרות שהיו בנות 3 חודשים בתחילת הניסוי. חולדות בית בודדות בכלובים המצוידים ביחידת זרימה למינרית ומסנן אוויר במתקן טיפול בבעלי חיים מבוקר טמפרטורה ולחות, מוסמך על ידי האגודה האמריקאית להסמכה לטיפול בחיות מעבדה (AAALAC) במחזור אור/חושך הפוך של 12 שעות (האורות כבויים בשעה 0600).
2. ספק מים וצ'או מכרסמים רגיל בחופשיות עד שמשקל הגוף הוא כ-380 - 400 גרם. לאחר מכן, להגביל מזון של חולדות ולשמור על 85 עד 90% ממשקל הגוף שלהן במהלך מפגשי הניסוי כדי להקל על רכישה ותחזוקה של תגובה למתאמפטמין.
3. לטפל במכרסמים בחדר הכלוב הביתי מדי יום מהגעתם לאורך כל מפגשי הניסוי על מנת לתעד את משקל הגוף ולהתאים את הקצאת המזון היומית.
4. לאחר השגת משקלי היעד, התכוננו להשתיל כל חולדה בניתוח עם קטטר צוואר כרוני ואלקטרודות מגרות תוך גולגולתיות.

2. הכנת קטטר

צנתור וריד צוואר

1. 1. הכן צינור סילסטי באורך 13 ס"מ בקוטר פנימי של 0.012 x 0.025', צור כדור סיליקון 4 ס"מ מקצה אחד של הצינור באמצעות צינורות סיליקון נוספים ואלקטרו-צריבה והניח לייבוש באוויר.
   2. טובלים את הקצה השני של הצינור בממס על בסיס לימונן שמקורו בהדרים למשך מספר דקות ומניחים לו להתרחב. חבר את הצינור המורחב לצינורית מנחה מנירוסטה כפופה בזווית ישרה.
   3. עוגן את הבסיס הכפוף של צינורית ההנחיה מנירוסטה לריבוע בגודל 1 אינץ' של רשת תואמת ביולוגית באמצעות מלט אקרילי דנטלי.
   4. שטפו את הקטטר מבפנים ומבחוץ עם אתנול ומים מזוקקים. הזרקת אוויר דרך הצינור כדי למנוע טיפות נוזל שנותרו. מניחים לייבוש למשך הלילה (O/N).
2. טכניקה סטרילית
   1. בצע את כל הניתוחים בסוויטה כירורגית ייעודית לבעלי חיים תוך שימוש בטכניקות כירורגיות אספטיות. עקרו מכשירים ושתלים באמצעות חיטוי והכינו אזור סטרילי על ידי הנחת נייר עמיד למים על שולחן הניתוחים (OR) המכוסה במגבת סטרילית.
   2. ללבוש כפפות סטריליות ולשמור את כל המכשירים, השתלים והגזה הכירורגית על האזור הסטרילי במהלך ההליך. נגב כל מכשיר עם ספוגית אלכוהול ואחריה 20 שניות במעקר חרוזים בין הליכים כאשר מבוצעים ניתוחים מרובים.
3. הרדמה
   1. חולדות טרום טיפול עם אטרופין (סולפט) (0.04 מ"ג/ק"ג, s.q.) ואחריו פנטוברביטל (20 - 50 מ"ג/ק"ג, ip) להשגת הרדמה.
   2. להזריק לבעלי חיים תרחיף פרוקאין סטרילי של פניצילין G (75,000 יחידות, תוך שרירי [i.m.]) וחומר משכך כאבים (קרפרופן, 5 - 10 מ"ג/ק"ג, sc או קטופרופן, 2 - 5 מ"ג/ק"ג, sc) מיד לפני הניתוח כדי להפחית זיהומים וכאבים סביב הניתוח, בהתאמה.
   3. בדוק אם יש הרדמה מספקת על ידי מתן צביטה מתונה בבוהן לבעל החיים, ואם לא מתרחשת תגובה, המשיך. יש למרוח חומר סיכה לעיניים על שתי העיניים.
4. הכנת אתר ניתוח
   1. לגלח טלאי גב בגודל 2X2 ס"מ על גב החולדה ממש מאחור לקו המחבר בין השכמות. לגלח טלאי גחון בגודל 1X1 ס"מ באזור הצוואר הימני בין עצם הלסת לעצם החזה.
   2. נגב את האזורים המגולחים עם רפידות אלכוהול ואחריו תמיסת בטדין. הניחו את החולדה על מגבת סטרילית והניחו לבטדין להתייבש לפני שתמשיכו.
5. השתלת קטטר
   1. בצע חתך במקביל לקו המחבר את השכמות באזור אמצע השכמה בגב באמצעות סכין בעלת 10 להבים. השתמש בהמוסטט כדי להפריד את העור מרקמת החיבור הבסיסית כדי ליצור מישור לבסיס צנתר הרשת. השקו את האזור במי מלח סטריליים וכסו אותו בגזה סטרילית לפני הפיכת החולדה על גבה.
   2. בצע חתך אלכסוני בין עצם הלסת הימנית לעצם החזה בעזרת סכין בעלת 10 להבים. השתמש בהמוסטט כדי להפריד את העור מרקמת החיבור הבסיסית כדי לאתר את וריד הצוואר.
      הערה: וריד הצוואר נראה לבן/כסוף ומבריק, והוא גדול יותר בחולדות זכרים מאשר בנקבות.
   3. הניחו מרית מתחת לווריד, קשרו תפר משי 4-0 בעדינות סביב החלק העליון (החלק הפרוקסימלי) של הווריד החשוף, ודחפו את הווריד בחזרה לתוך הצוואר.
   4. הפרד את רקמות החיבור ליצירת כיס שטחי מתחת לעור הצוואר התחתון אך מעל השריר. דחוף טרוקר מעוקר מהחתך בצוואר לחתך האמצעי על ידי מנהרה לאחור מאחורי הזרוע ולמעלה. העבירו את הקטטר מהגב לצוואר על ידי החדרת חוט מנחה קשיח למעלה דרך הטרוקר מקצה הצוואר לתוך הצנתר הדיסטלי. משוך את חוט ההנחיה בחזרה עד לחתך הצוואר, והצנתר הדיסטלי המצורף יבוא בעקבותיו.
   5. בודד את וריד הצוואר הימני מעל מרית על ידי משיכה כלפי מעלה על התפר הפרוקסימלי שהונח קודם לכן. השתמש במספריים כדוריים כדי לבצע חתך חלקי קטן בצד העליון של הווריד.
   6. הכנס מלקחיים מעוקלים לחתך הווריד כדי לפתוח אותו. תוך שמירה על המלקחיים בנפרד אך במקומם, העבירו את קצה הקטטר בין קצות המלקחיים ולתוך הווריד כ-2-3 ס"מ, שם הוא יסתיים מחוץ לאטריום הימני.
   7. אבטח את הקטטר על ידי קשירת תפר משי 4-0 סביב הווריד הדיסטלי. קושרים את התפרים הפרוקסימליים והדיסטליים יחד בקשר "קופסה" כדי להוסיף יציבות נוספת.
   8. שטפו את הקטטר במי מלח סטריליים שעברו הפרין ושאבו דם כדי לאשר השתלה מוצלחת. חתוך את התפרים 1 - 2 מ"מ מעל הקשרים ותוחב את הצנתר הפרוקסימלי שנותר מתחת לעור הצוואר. סגור עם תפר / שיטה מתאימה לבחירתך. אם משתמשים בתפרים או סיכות שאינם נספגים, יש להסירם תוך 10-14 יום בהרדמה כללית. יש לכסות את החתך במשחה אנטיביוטית באמצעות אפליקטור סטרילי עם קצה כותנה.
   9. עוגן את מכלול הצנתר הדיסטלי/צינורית מנחה/רשת לרקמה האחורית התת עורית באמצעות תפרים נספגים בשתיים מהפינות המנוגדות של בסיס הרשת. סגור את החתך האחורי סביב צינורית ההנחיה באמצעות תפרים נספגים קטועים ולא הפוכים. יש לכסות את החתך במשחה אנטיביוטית באמצעות אפליקטור סטרילי עם קצה כותנה.
6. טיפול לאחר הניתוח
   1. שטוף את הקטטר בתמיסת מלח סטרילית של 0.9% באמצעות מזרק של 3 מ"ל והנח אובטורטור לתוך צינורית ההנחיה כדי למנוע סתימה.
   2. יש לשטוף את הצנתר של כל חולדה על בסיס יומי כדי לשמור על סבלנות.
   3. מיד לאחר ההליך, הניחו את החולדה בכלוב הביתי שלה מעל כרית חימום בחדר הניתוח והתבוננו עד שההכרה והתנועה הספונטנית יחזרו.
   4. החזירו את החולדה שהחלימה לחדר המושבה והניחו לחמישה עד שבעה ימים לעבור לפני ניתוח תוך גולגולתי. שקלו, טפלו והעריכו את מצבם הכללי מדי יום, כולל בדיקת זיהום והערכת התנהגות, מראה ורמות פעילות של בעלי חיים.
   5. התייעץ עם הווטרינר של משאבי בעלי חיים אם מתעוררות בעיות כלשהן ופעל לפי כל משטרי הטיפול המומלצים. להזריק לבעלי חיים חומר משכך כאבים (קרפרופן, 5 - 10 מ"ג/ק"ג, sc או קטופרופן, 2 - 5 מ"ג/ק"ג, sc) לטיפול בכאב סביב הניתוח לפי הצורך.

3. הכנה כירורגית למיקום אלקטרודה תוך גולגולתית

1. בצע את כל הניתוחים בתנאים סטריליים כמתואר בסעיף 2.2.
1. הרדמה
   1. הנח את בעל החיים בתא אינדוקציה להרדמה וספק זרימת גז איזופלורן לתוך התא ב-1,000 - 2,000 מ"ל/דקה כאשר הוופורייזר מוגדר על 5%.
   2. לאחר שהחיה שוכבת, הוציאו אותה מהתא והניחו אותה בקונוס האף על פלטפורמת ההפעלה הסטריאוטקטית המרופדת. העבירו את זרימת הגז מהתא לחרוט האף והפעילו את הגז כשהאידוי מוגדר על 2 - 3%.
   3. כוונן את הוופורייזר לפי הצורך כדי לשמור על נשימה יציבה וללא תגובה לגירוי במהלך הניתוח.
   4. יש להזריק לחולדה תרחיף פרוקאין סטרילי של פניצילין G (75,000 יחידות, כלומר) וחומר משכך כאבים (בופרנורפין 0.05 עד 0.5 מ"ג/ק"ג sc) מיד לפני הניתוח כדי להפחית זיהומים וכאבים סביב הניתוח, בהתאמה.
   5. בדוק אם יש הרדמה מספקת על ידי מתן צביטה מתונה בבוהן לבעל החיים, ואם לא מתרחשת תגובה, המשיך. יש למרוח חומר סיכה לעיניים על שתי העיניים.
2. הכנת אתר ניתוח
   1. לגלח את החלק העליון של ראש החולדה ולהניח את החולדה בסורגי אוזניים כדי לשמור על ראשה ללא תנועה במהלך ההליך. נגב את האזור המגולח עם רפידות אלכוהול ואחריו תמיסת בטדין. הניחו לבטדין להתייבש לפני שתמשיכו.
3. השתלת אלקטרודה
   אחוז
   1. בקרקפת בין האוזניים ומעט קדמית אליהן בעזרת מלקחיים והשתמש במספריים כדי לחתוך את הבסיס. תמרון זה יסיר שטח עור בגודל 1.5X1 ס"מ מעל אמצע הגולגולת.
   2. השתמש ב-10 להבים כדי לבצע חתך היקפי דרך הגולגולת עד לגולגולת, ובמלקחיים מעוקלים כדי לגרד ולהסיר את הגולגולת. השקו את האזור במי מלח סטריליים, טפחו עודפי דם ותמיסת מלח בגזה, והניחו לגולגולת להתייבש לחלוטין כך שניתן יהיה לראות בבירור את ציוני הדרך הגרמיים, כולל הברגמה.
   3. לניתוח דו-צדדי, הרכיב שתי אלקטרודות פלטינה-אירידיום דו קוטביות, אחת לכל מחזיק אלקטרודה משני צידי פלטפורמת ההפעלה הסטריאוטקטית. הזז את האלקטרודה הראשונה למצב ~1 מ"מ מעל הברגמה ורשום את הקואורדינטות הסטריאוטקטיות עבור המיקומים הקדמיים-אחוריים (AP) והמדיאליים-רוחביים (ML), שיוצגו בתצוגה הדיגיטלית. אל תיגע בקצה האלקטרודה בגולגולת מכיוון שהאלקטרודה לא תפעל יותר. חזור על הליך זה עבור האלקטרודה השנייה.
   4. חשב את קואורדינטות ה-AP וה-ML הסופיות על סמך מבנה היעד המעניין. הזז את האלקטרודה למצב זה עם הקצה ממש מעל הגולגולת כדי לקבל את הקואורדינטות הראשוניות של ה-dorsoventral (DV) בתצוגה הדיגיטלית. חשב את עומק ה-DV הסופי על סמך מבנה היעד המבוקש.
      הערה: מעטפת גרעין האקומבנס הייתה ממוקדת בדוגמה זו, בהתחשב במעורבותה הידועה בהתנהגות של צריכת תרופות, תוך שימוש בקואורדינטות הסטריאוטקטיות הבאות ביחס ל-bregma:קואורדינטות כניסת AP = [קואורדינטות מוצגות דיגיטלית ב-bregma] + קואורדינטת כניסה של 1.6 מ"ל = [קואורדינטות מוצגות דיגיטלית ב-bregma] ±-2.4 עבור ימין/שמאלעומק DV = [קואורדינטות מוצגות דיגיטלית על פני הגולגולת בכניסה AP/ML] - 8.5
   5. סמן את מיקום הכניסה הצפוי של כל אלקטרודה על פני הגולגולת עם סמן קבוע. אין להיתקל או לגעת בקצה האלקטרודה במהלך תמרון זה.
   6. השתמש בכדור עגול מצופה יהלום כדי לקדוח חור של 1.4 מ"מ בכל סימן. היזהר לא לצלול דרך הגולגולת לתוך הקמרון התוך גולגולתי עם המקדחה המהירה. השתמש במלקחיים מעוקלים כדי לנקב את הדורה לאחר קידוח הגולגולת.
   7. השתמש בכדור עגול מצופה יהלום כדי לקדוח חורים של 0.7 מ"מ בארבעה מיקומים נוספים מאחורי כניסות האלקטרודה למיקום ברגי גולגולת. השתמש במברג ידני כדי להכניס ארבעה ברגי נירוסטה 0.8 (קוטר) x 3.2 (אורך) מ"מ לתוך הגולגולת, שניים בכל צד של קו האמצע. אבטח היטב את הברגים הללו עד כמחצית אורכם לתוך הגולגולת מכיוון שהם התשתית העיקרית שתחזיק את מכסה הגולגולת במקומו בשבועות ובחודשים הקרובים.
   8. הכנס בזהירות את האלקטרודה הראשונה דרך החור שלה לתוך המוח לעומק ה-DV המחושב על ידי סיבוב ידני של הכפתור שמנהל את קואורדינטות ה-Z של מחזיק האלקטרודה. סובב את הכפתור בקצב השווה בערך ל-1/2 סיבוב לשנייה כדי למנוע נזק מיותר לקצה האלקטרודה. ודא שקצה האלקטרודה אינו נוגע בקצה הגרמי של החור בעת הכניסה למוח.
   9. אבטח את האלקטרודה הראשונה באמצעות דבק סופר שכבתי מעל החור והברגים האחוריים, ואחריו מלט דנטלי. לאחר שמבנה זה התייבש לחלוטין, הסר את האלקטרודה מהמחזיק שלה. חזור על תהליך ההחדרה והמלט עבור האלקטרודה השנייה. מרחו צמנט דנטלי עד לקצה העור, אך אל תחפפו עם העור מכיוון שזה משחרר את מכסה המלט הגולגולתי לטווח ארוך.
4. טיפול לאחר הניתוח
   1. הנח שני מכסי אבק מעל כני האלקטרודה כדי למנוע סתימה.
   2. מיד לאחר ההליך, הניחו את החולדה בכלוב הביתי שלה מעל כרית חימום בחדר הניתוח והתבוננו עד שההכרה והתנועה הספונטנית יחזרו.
   3. החזירו את החולדה ששוחזרה לחדר המושבה והניחו לחמישה ימים לעבור לפני תחילת הניסוי. שקלו, טפלו והעריכו את מצבן הכללי של החולדות מדי יום, כולל בדיקת זיהום והערכת התנהגות, מראה ורמות פעילות של בעלי חיים.
   4. התייעץ עם הווטרינר של משאבי בעלי חיים אם מתעוררות בעיות כלשהן ופעל לפי כל משטרי הטיפול המומלצים. להזריק לבעלי חיים חומר משכך כאבים (בופרנורפין 0.05 עד 1 מ"ג/ק"ג sc) לטיפול בכאב סביב הניתוח לפי הצורך. דימום תוך גולגולתי יכול להיות נפוץ יותר עם שימוש בתרופות נגד כאבים שאינן סטרואידיות (קרפרופן, 5 - 10 מ"ג/ק"ג, sc או קטופרופן, 2 - 5 מ"ג/ק"ג, sc), לכן השתמש בבופרנורפין סביב הניתוח לניתוח תוך גולגולתי.

4. מנגנון אופרנטי

1. השתמש בתאי מיזוג אופרנטיים מפלסטיק ונירוסטה הכלולים בתוך מארזים מחלישי קול כדי להפעיל את הניסויים ההתנהגותיים.
2. ציידו כל מארז במאוורר פליטה כדי לספק אוורור ורעש לבן כדי להסוות צלילים זרים.
3. השתמש במחשב אישי ובמערכת ממשק תוכנה התנהגותית כדי לתכנת את הנהלים ולאסוף את נתוני הניסוי.
4. הגדרה כללית
   1. ציידו כל תא ניסוי בשני מנופי תגובה המותקנים על קיר אחד של החדר, עם נורית גירוי הממוקמת מעל כל מנוף. ייעד את אחד המנופים כמנוף "פעיל" כך שיביא לתוצאה מתוכנתת בעת לחיצה.
   2. תכנת אור גירוי הממוקם ישירות מעל ידית התגובה האקטיבית כדי להאיר במהלך כל הפעלה אופרנטית, המציינת את זמינות התרופה.
   3. תגובה על הידית האקטיבית תביא למתן עירוי של מתאמפטמין (0.05 מ"ג/ק"ג/עירוי ב-100 מיקרוליטר 0.9% NaCl) במשך 2.8 שניות, מלווה בתאורת הבית על הקיר הנגדי שנדלקת למשך 5 שניות ונורת הגירוי נכבית למשך פסק זמן של 30 שניות.
   4. ספור תגובות על הידית הפעילה, אך לא אמורות להיות להן השלכות מתוכננות במהלך פרק הזמן הקצוב של 30 שניות. לסיום, רשום תגובות על הידית הלא פעילה אך לא אמורות להיות להן השלכות מתוזמנות.

5. נוהל ניהול עצמי של מתאמפטמין תוך ורידי (IV)

1. הכנות כלליות
   1. העמיסו חולדות לתוך חדרי האופרנט במהירות וברוגע ככל האפשר כדי למזער חפצים התנהגותיים. חבר רצועת קפיצי נירוסטה לצינורית ההנחיה בגב המכרסם ולמסתובב נוזל חסין דליפות התלוי מעל תא האופרנט.
   2. ודא את תקינות צינור החיבור מהמסתובב למזרק התרופות בנפח 20 מ"ל במשאבה מונעת מנוע הממוקמת מחוץ למארז מחליש הרעש. לשם כך, דחוף את צינור חיבור הפלסטיק לפחות 1/4 אינץ' על קצה מסתובב המתכת ואת קצה מחט מזרק התרופות עד שהוא לא יחליק במשיכה מתונה. איזון נגד מכלול המסתובב והרצועה כדי לאפשר תנועה בלתי מרוסנת יחסית של בעל החיים.
   3. ערכו מפגשים אופרנטיים בערך באותה שעה בכל יום, שני עד שישי.
2. Acquisition
   1. על מנת להקל על רכישה מהירה של מתן עצמי של מתאמפטמין IV, הפעל חולדות במפגשים יומיים של 6 שעות במשך ארבעה עד חמישה ימים רצופים.
   2. ערכו את המפגשים הללו ביחס קבוע FR-1 + לוח זמנים של 30 שניות של חיזוק שבמהלכו החולדות מקבלות עירוי אחד של מתאמפטמין לווריד עבור כל לחיצה על הידית הפעילה, ולאחר מכן פסק זמן של 30 שניות (למשל, לא מתרחשות השלכות של רמז או תגמול בלחיצה על אף אחד מהמנופים).
      הערה: גישה ראשונית ממושכת ו"קלה" זו תביא לכך שרוב המכרסמים ירכשו התנהגות משמעותית של נטילת סמים בפחות או שווה ל שבוע אחד (איור 3).
3. תחזוקה
   1. במהלך השבוע השני של האימון, הפעל חולדות במפגשים יומיים של שעתיים בימים שני עד שישי כדי לשמור ולחדד את המתן העצמי של מתאמפטמין לווריד.
   2. ערכו מפגשים ביחס קבוע FR-1 + 30 שניות של פסק זמן של חיזוק.
   3. תעד תגובה יציבה ואינטנסיבית כאשר המספר הכולל של מצגות מתאמפטמין בכל מפגש משתנה פחות מ-10% במשך שלושה מפגשים רצופים (איור 4) והמספר המצטבר של עירויים במהלך 30 הדקות הראשונות גדול מהמספר המצטבר של עירויים במהלך 30 הדקות השניות (איור 5).
      הערה: קריטריון זה מבטיח שהחולדות יפתחו דפוס העמסת סמים בתחילת הפגישה המעיד על התנהגות ממכרת ולא רק על שימוש מזדמן.
4. Post-Session
   1. בסוף כל מפגש, נתק את הרצועה מגב המכרסם. יש לשטוף את הקטטר ב-0.1 מ"ל של תמיסת מלח 0.9% המכילה סטרפטוקינאז 800 יחב"ל למניעת קרישי דם. הכנס אובטורטור לכל צינורית מנחה כדי למנוע סתימה לפני החזרת החולדות לכלובי הבית.
   2. בדוק את הסבלנות של הצנתרים מיד לאחר סיום כל מפגש ניסוי בימי רביעי במהלך הניסוי.
      1. הכן מזרק 3 סמ"ק עם מחט 22 גרם, המכיל תמיסת מלח בקטריוסטטית הפרינית לבדיקת סבלנות הצנתר. חבר קצה אחד של חתיכת צינור פלסטיק באורך 4 עד 6 אינץ' למחט ואת הקצה השני לעמוד המתכת של מכלול צינורית הצנתר בגב החיה.
      2. יש להחדיר 0.1 עד 0.2 מ"ל מי מלח כדי להבטיח זרימה ברורה ולאחר מכן למשוך את בוכנת המזרק לאחור. אם הצנתר רשום כפטנט, עליו גם לשטוף בקלות וגם לשאוב בחזרה דם שיהיה גלוי בצינור. שחרר את הבוכנה והחדיר עוד 0.2 מ"ל כדי לשטוף את כל הדם בחזרה דרך הצנתר.
      3. אם לא ניתן להוציא דם, הסר את המזרק והצינור בנפח 3 סמ"ק מעמוד המתכת.
      4. הכן מזרק 1 סמ"ק עם מחט 22 גרם, המכיל נתרן מתוהקסיטל, חומר הרדמה מהיר, כדי לבדוק עוד יותר את סבלנות הצנתר. חבר קצה אחד של חתיכת צינור פלסטיק באורך 4 עד 6 אינץ' למחט ואת הקצה השני לעמוד המתכת של מכלול צינורית הצנתר בגב החיה.
      5. יש להחדיר 1.5 מ"ג ולהסיר במהירות את המזרק והצינור בנפח 1 סמ"ק מעמוד המתכת בגב החיה. חבר מחדש את המזרק בנפח 3 סמ"ק המלא במי מלח בקטריוסטטיים הפריניים והחדיר 0.1 - 0.2 מ"ל. אם החיה מאבדת את טונוס השרירים תוך 3 שניות, אז הקטטר הוא פטנט ופונקציונלי.
5. ראה את הקובץ המשלים "מלכודות נפוצות" לסעיף מלכודות שמתייחס לתגובות שליליות למתאמפטמין, כישלון ברכישת מתאמפטמין במתן עצמי וקושי במיצוי חולדות.

6. מכשיר גירוי מוחי

1. השתמש ב-10 עד 12 קופסאות פרספקס (12 x 18 x 18 אינץ') (רוחב x גובה x ד) כדי להפעיל את ניסויי ה-DBS. כסו כל קופסה מבחוץ בנייר אטום נוקשה המכסה את החלק האחורי והצדדים של הקופסה כדי למנוע מהחולדות לראות או לתקשר זו עם זו. השאר את הפאנל הקדמי השקוף חשוף כדי שהבוחן יוכל לראות את החיות במהלך מפגשי הגירוי.
2. מכסים את החלק העליון של הקופסאות בלוח חדיר למחצה המונע מהחולדות לברוח ומאפשר זרימת אוויר. השתמש בפאנל זה כדי לתמוך בקומוטטורים הממוקמים מעל כל קופסה כדי להקל על החיבור החשמלי בין מכסה ראש המכרסם למערכת הגירוי.
3. השתמש במערכת גירוי שיכולה לספק זרם קבוע למספר בעלי חיים בו זמנית עבור ניסויי DBS. השתמש במערכת המורכבת ממעבד אותות דיגיטלי/ממשק תקשורת הניתנים לתכנות על ידי המשתמש, ממריץ, מארז סוללות ממריץ, קופסת מפצל ערוצים והתוכנה הנלווית (ראה גיליון חומרים).
4. השתמש בכבלים באורך מותאם אישית כדי לחבר את יציאות הערוץ של הממריץ לכן האלקטרוני המעולה של כל קומוטטור.
   הערה: האורך הדרוש יהיה תלוי במעבדה הבודדת. כבלים אלה נמצאים מחוץ לאזור בעלי החיים ואין צורך לכסות אותם בקפיץ נירוסטה.
5. חבר את הכן האלקטרוני התחתון של הקומוטטור לכן האלקטרודה המושתלת על מכסה הראש של המכרסם באמצעות כבלים בגודל 16 אינץ' המכוסים בקפיץ נירוסטה. ודא שהכבלים ארוכים מספיק כדי לאפשר תנועה חופשית לכל אזור במארז ללא מתח משמעותי על מכסה הראש.
   הערה: כבל שמסתיים בערך במקום שבו ראש החולדה יהיה בעמידה על ארבע הרגליים הוא בדרך כלל מספיק.
6. Brain Stimulation Programming
   1. השתמש במחשב אישי ובתוכנת תכנות כדי לתכנת את פרמטרי הגירוי (למשל, צורת גל, תדר, רוחב דופק, עיכוב בין גירויים, משרעת זרם) ולאסוף את נתוני הניסוי.
   2. באמצעות שפת תכנות ויזואלית, ציין אילו פונקציות יבצע כל מכשיר כדי לעמוד בנקודות הקצה הניסיוניות ואילו נתונים יאוחסנו ו/או יוקרנו לצפייה בזמן אמת. הפקודות שמפעילות את הפרויקט הספציפי הזה מוצגות באיור 1.
   3. ציין את התדר, רוחב הדופק והמשרעת הרצויים בלוח הבקרה החזותי (איור 2) לפני תחילת הניסוי. פרמטרים אופייניים לגירוי בתדר גבוה בחולדות דומים לאלה המשמשים בגירוי מוחי עמוק אנושי קליני: תדר של 130 עד 180 הרץ, רוחב דופק של 60 עד 90 msec ומשרעת זרם של 100 עד 250 μA4,8-10.
      הערה: במכרסם משתמשים בזרם נמוך יותר בשל גודלו הקטן בהשוואה לפרימט.

7. נוהל גירוי מוחי עמוק

1. כדי להעמיס חולדות לקופסאות, חבר את כבל קפיץ הנירוסטה מהקומוטטור לכל הדום אלקטרודה על מכסה הראש. בדוק את העכבה של כל אלקטרודה על ידי הפעלת זרם של 5 μA בתדר של 1,000 הרץ למשך 2 שניות.
   1. אם העכבה שווה או קטנה מ-125 KOhm, המשך בניסוי מכיוון שהאלקטרודה מסוגלת לספק גירוי טיפולי. אם העכבה גדולה מ-125 קילו-אוהם, שקול להוציא את החיה מהניסוי מכיוון שההתנגדות הגבוהה של האלקטרודה עלולה לחתוך את הזרם לרמות תת-טיפוליות פוטנציאליות.
2. העבירו את החולדות דרך מפגש מדומה אחד או שניים להתרגלות, שבמהלכם הן יחוברו לכבלי האלקטרודה אך לא יקבלו טיפול פעיל. בדיקות מדומה יבטלו כל השפעות התנהגותיות לא ספציפיות. מיד לאחר כל מפגש מדומה, העבירו את החולדות לקופסאות האופרנט לסשן יומי של שעתיים של מתן עצמי של מתאמפטמין לווריד.
3. איזון נגד חולדות לשתי קבוצות, עוקבת גירוי פעיל וגירוי דמה, כך שצריכת התרופות הבסיסית אינה שונה באופן משמעותי בין הקבוצות.
4. בצע מפגשי DBS יומיים על קבוצת המכרסמים במשך 5 ימים, במהלכם הם מקבלים גירוי מוחי חשמלי פעיל או ללא גירוי במשך 3 שעות בהתאם למשימה הקבוצתית שלהם. מיד לאחר כל מפגש DBS, העבירו חולדות לקופסאות האופרנט לסשן יומי של שעתיים של מתן עצמי של מתאמפטמין לווריד.
   1. התבונן בבעלי חיים בקפידה במהלך לפחות חלק מכל מפגש DBS כדי לוודא שהגירוי אינו גורם לשינויים ברורים בהתנהגות בעלי החיים. אם מתרחשות התנהגויות חריגות כלשהן במהלך / אחרי הגירוי, הקפד לתעד את התצפיות הללו. הערה: המחברים לא הבחינו בשינויים התנהגותיים משמעותיים או בשינויים בצריכת מזון/מים במהלך הניסוי המתואר במאמר זה.
5. שנה את משך הטיפול ב-DBS, את הפרמטרים החשמליים ואת הזמן בין סשן ה-DBS לפגישה האופרנטית לפי הצורך, בהתאם להשערה.

תוצאות

איור 1. שפת תכנות חזותית. החוקר משתמש בשפת תכנות חזותית, כמו הדוגמה המוצגת כאן, כדי לעצב תוכנה שיכולה לספק גירוי מוחי למספר בעלי חיים בו זמנית בפרמטרים שהוזנו על ידי המשתמש.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Rodent operant chambers	Med Associates, Inc	ENV-008CT	Med Associates Inc. PO Box 319 St. Albans, Vermont 05478 USA טלפון: (802) 527-2343
Kopf Small Animal Stereotaxic Instrument עם קונסולת תצוגה דיגיטלית	Kopf Instruments	דגם 940	טלפון Kopf: 1-877-352-3275 פקס: 1-818-352-3275 דוא"ל: sales@kopfinstruments.net
Z-Series 3-DSP Bioamp	Processor Tucker Davis Technologies	RZ5D	Tucker-Davis Technologies 11930 מעגל מחקר Alachua, FL 32615 ארה"ב טלפון: 386-462-9622
ממריץ 32 ערוצים מסדרת www.tdt.com Z	Tucker Davis Technologies	IZ2-32	התוכנה מלווה במדריך הדן כיצד לתכנת ניסויים באמצעות פלטפורמת OpenEx, אליו ניתן לגשת כאן:
http://www.tdt.com/files/manuals/OpenEx_User_Guide.pdf מארז סוללות LI-ION 48 וולט עבור ממריץ IZ2	Tucker Davis Technologies	LZ48-200
תיבת מפצל 32 ערוצים עבור PZ5	Tucker Davis Technologies	S-BOX_PZ5
חבילת תוכנה OpenEx Ext להקלטה עצבית רב-ערוצית	טאקר דייוויס טכנולוגיות	OpenEx
פלטינה-אירידיום אלקטרודות מגרות	פלסטיק One Inc	MS303/8-B/SPC ELECT PT 2C TW .005 "	Plastics One Inc P.O.Box 21465, S.W. Roanoke, VA 24018, PH 540-772-7950
כבלים דו-ערוציים בין סטימולטור לקומוטטור	פלסטיק אחד בע"מ	305-441/2 W/ אביב
כבלים דו-ערוציים בין קומוטטור להדום אלקטרודה	פלסטיק One Inc	305-305 W/ קפיץ
קומוטטורים 4 ערוצים	פלסטיק One Inc	SL2+2C ו-SL2+SC/SB