מאמר שיטה
470 צפיות
⸱
29 באוגוסט 2025
סרטון זה מדגים השתלה של תאי אב עצביים שמקורם בתאי גזע לפרוסות רקמת קליפת המוח האנושית. ההליך כולל בידוד והשעיה מחדש של תאי אב במטריצת קרום מרתף, ולאחר מכן הזרקתם לפרוסה קליפת המוח המונחת על מכלול טרנסוול. לאחר הדגירה כדי לאפשר התמצקות מטריצה והתמיינות עצבית, הרקמה המושתלת מוכנה לניתוח נוסף.
כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות ה-IRB של המכון.
1. התפשטות והתמיינות של תאי lt-NES
הערה: תאי גזע דמויי נוירו-אפיתל (lt-NES) שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם נוצרים ומומרים עם וקטור לנטי-ויראלי הנושא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת מקדם מכונן (תאי GFP-lt-NES). בקבוקונים המכילים 3 x 106 תאים מאוחסנים בטמפרטורה של -150 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
1. הכנת פתרונות המניות והמדיה
1. יש לדלל 100 מיקרוגרם של גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF) ב-10 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) -0.1% אלבומין בסרום בקר (BSA) כדי לקבל ריכוז מלאי של 10 מיקרוגרם/מ"ל. הכן 100 מיקרוליטר מכונות.
2. לדלל 100 מיקרוגרם של גורם גדילת האפידרמיס (EGF) ב-10 מ"ל של PBS-0.1% BSA כדי לקבל ריכוז מלאי של 10 מיקרוגרם/מ"ל. הכן 100 מיקרוליטר מכונות.
3. תוספת Aliquot 50x B27 בנפח של 100 מיקרוליטר לכל אליקווט.
4. לדלל 10 מ"ג של פולי-L-אורניתין ב-100 מ"ל של מים נטולי יונים כדי לקבל ריכוז מלאי של 100 מיקרוגרם/מ"ל. הכינו 1 מ"ל אליקוטים.
5. הכן 30 מיקרוליטר של 1.20 מ"ג/מ"ל למינין עכבר.
6. לדלל 10 מ"ל של חומצה טריפסין-אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) (0.25%) ב-90 מ"ל של PBS לריכוז מלאי של 0.025%. הכן 1 מ"ל אליקוטים.
7. יש לדלל 0.025 גרם של מעכב טריפסין ב-50 מ"ל של PBS לריכוז מלאי של 0.5 מ"ג/מ"ל. הכן 1 מ"ל אליקוטים.
8. לדלל 10 מיקרוגרם של Wnt3a (בן משפחה של אתר אינטגרציה MMTV מסוג Wingless 3A) ב-1 מ"ל של PBS-0.1% BSA כדי לקבל ריכוז מלאי של 10 מיקרוגרם/מ"ל. הכן BMP4 (חלבון מורפוגנטי עצם 4) באותו אופן. Aliquot לנפח של 100 מיקרוליטר.
9. לדלל 1 מ"ג של ציקלופמין ב-2.5 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) לריכוז סופי של 400 מיקרוגרם/מ"ל, וליצור 100 מיקרוליטר אליקוטות.
10. הכן מדיום בסיסי (טבלה 1) ומדיום מוגדר בידול (DDM, טבלה 2), ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שבועיים.
2. ציפוי כלי תרבות
1. כדי לצפות מראש את הכלים לתרבית תאי GFP-It-NES במהלך התפשטות או התמיינות, יש לדלל פולי-L-אורניתין 1:100 במים נטולי יונים ולהוסיף 5 מ"ל מהתמיסה לבקבוק T25. דגירה למשך הלילה בטמפרטורת החדר (RT).
2. שטפו את הצלחות המצופות פולי-L-ornithine 1x במים נטולי יונים ו-1x עם PBS.
3. עבור תאי GFP-It-NES בשגשוג, יש לדלל את הלמינין של העכבר ב-1:500 ב-PBS ולדגור למשך שעתיים לפחות ב-37 מעלות צלזיוס. עבור תאי GFP-It-NES בהתמיינות, יש לדלל את הלמינין של העכבר ב-1:100 ב-PBS ולדגור לפחות שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס.
3. התפשטות תאי GFP-lt-NES
1. חם 5 מ"ל (לכביסה) ו -5 מ"ל (לזריעה) של מדיום בסיסי בשני צינורות שונים של 15 מ"ל.
2. הפשירו במהירות בקבוקון אחד של תאי GFP-lt-NES ב-37 מעלות צלזיוס, העבירו אותם לצינור הכביסה וצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות.
3. שאפו את המדיום בזהירות מבלי לגעת בגלולה והשעו מחדש את התאים ב-1 מ"ל של מדיום בסיסי שחומם מראש. העבירו את תרחיף התאים לצינור הזריעה המכיל מדיום בסיסי בתוספת גורמי התפשטות: EGF (10 ננוגרם/מ"ל), bFGF (10 ננוגרם/מ"ל) ו-B27 (10 ננוגרם/מ"ל). זרעו את התאים על בקבוק T25 מצופה פולי-L-אורניתין/למינין.
4. האכילו את התאים בגורמי התפשטות מדי יום. החלף את המדיום אם הוא הופך לצהוב. מעבר התאים כל יום שלישי או רביעי (יום אחד לאחר שהם מגיעים למפגש של 100%).
4. פיצול תאי GFP-lt-NES לצורך התפשטות והתמיינות
1. יש לחמם מראש 5 מ"ל של מדיום בסיסי לכל בקבוק (כדי לאסוף את התאים), בתוספת הנפח הכולל הדרוש לזריעה מחדש.
הערה: המעבר נעשה בדילול של 1:3 כדי לשמור על התאים בשגשוג, הדורש 15 מ"ל של מדיום בסיסי, ודילול של 1:6 כדי להתחיל התמיינות, הדורש 30 מ"ל של מדיום בסיסי.
2. הסר את המדיום מבקבוק תרבית התאים על ידי שאיפה והוסף 500 מיקרוליטר של 0.025% טריפסין מחומם מראש. דגירה למשך 5-10 דקות ב- RT. ניתן לאשר את ניתוק התאים במיקרוסקופ אור סטנדרטי בהגדלה של פי 10.
3. הוסף נפח שווה של מעכב טריפסין (ריכוז סופי של 0.5 מ"ג/מ"ל) ואחריו 5 מ"ל של מדיום בסיסי חם. נתק ואסוף את התאים על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה. העבירו את התאים לצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 300 x גרם.
4. כדי לשמור על התאים בשגשוג, יש לשטוף מחדש בדילול של 1:3 במדיום בסיסי טרי בתוספת גורמי התפשטות, ולחזור על שלב 1.3.4.
5. התמיינות קליפת המוח של תאי GFP-lt-NES
1. ביום 0, השעו מחדש את התאים (שישמשו להתמיינות) ב-30 מ"ל של מדיום בסיסי בתוספת גורמי התפשטות, וצלחו אותם בשש צלוחיות T25 מצופות התמיינות (פיצול 1:6).
2. ביום הראשון, שנה מחצית מהמדיום ל-DDM, והוסף גורמי התפשטות במחצית מהריכוז שלהם.
3. ביום השני, שנה את המדיום לחלוטין ל-DDM בתוספת גורמי התמיינות: BMP4 (10 ננוגרם/מ"ל), Wnt3a (10 ננוגרם/מ"ל) וציקלופאמין (400 ננוגרם/מ"ל).
4. ביום 4, הוסף את גורמי הבידול בלבד. החלף את המדיום אם הוא הופך לצהוב.
5. ביום 6, שנה את המדיום ל-DDM בתוספת BMP4 ו-Wnt3a. הציקלופמין מוסר בשלב זה.
6. ביום השביעי, נתק את התאים כאמור בשלב 1.4.2 ובשלב 1.4.3.
2. השתלת תאי GFP-lt-NES לפרוסות hACtx אורגנוטיפיות
הערה: יש לתרבית את רקמת קליפת המוח האנושית הבוגרת (hACtx) במשך שבוע לפני השתלת התאים. כדי להקל על הליך ההשתלה, יש צורך להסיר 2 מ"ל של מדיום hACtx מהחלק העליון של התוסף כדי למנוע את ציפה של הרקמה.
1. השעו מחדש את תאי ה-GFP-lt-NES המוכנים בקליפת המוח (משלב 1.5.6) במטריצת קרום בסיס טהור (ראה טבלת החומרים) בריכוז של 1 x 105 תאים/מיקרוליטר והעבירו את התמיסה לצינור סטרילי קטן יותר.
הערה: במהלך הליך ההשתלה, יש לקרר מראש את כל החומרים (קצות פיפטה, צינורות, נימים וכו') כדי למנוע התמצקות ג'ל. הפשירו את ג'ל מטריצת קרום המרתף על קרח למשך 30 דקות לפני השימוש בו.
2. אוספים את תרחיף התא לנימים מזכוכית קרה המחוברת לפטמת גומי ליניקה. הזרקו את תרחיף התאים כטיפות קטנות (כ-1 מיקרוליטר כל אחת) על ידי דקירת פרוסת הרקמה היבשה למחצה באתרים שונים.
3. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי שהג'ל יתמצק. העבירו את הצלחת מהחממה בחזרה למכסה המנוע והוסיפו בזהירות 2 מ"ל של מדיום hACtx לחלק העליון של התוספת כדי לטבול לחלוטין את הרקמה.
4. החלף את מדיום התרבות במדיום hACtx טרי פעם בשבוע.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
טבלה 1: הרכב מדיום הריבוי של תאי lt-NES (מדיום בסיסי).
| ריכוז מלאי | בינוני בסיסי | ריכוז סופי | לכל 100 מ"ל |
| DMEM/F12 עם L-Glutamine | 1x | 98.7 מ"ל | |
| תוסף N-2 | 100x |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| MANTAINANCE and CULTURE של רקמה ניאו-קורטיקלית אנושית | |||
| צלחת 6 בארות | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Alvetex פיגום 6 באר הכנס | Reinnervate Ltd | AVP004-96 | |
| תוסף B27 (50x) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | |
| BrainPhys ללא פנול | טכנולוגיות תאי גזע | #05791 | מוזכר כמדיום עצבי בטקסט |
| יחידות סינון 250 מ"ל או 500 מ"ל | קורנינג סיגמא | CLS431096/97 | |
| מלקחיים | כל | ||
| (50 מ"ג/מ"ל) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | |
| תוסף גלוטמקס (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | מוזכר כ-L-גלוטמין בטקסט |
| פטמת גומי + פיפטת זכוכית | כל < | ||
| 2-Mercaptoethanol 50 מ"מ | ThermoFisher Scientific | ||
| רקומביננטי ללא בעלי חיים EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 Suplemment (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
| בקר אלבומין שבר V (7.5% תמיסה) | ThermoFisher Scientific | 15260037 | |
| Cyclopamine, V. calcifornicum | calbiochem | # 239803 | |
| D (+) תמיסת גלוקוז (45%) | Sigma | G8769 | |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | Sigma Aldrich | D2438-10mL | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Salt (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | ללא סידן ומגנזיום |
| חלבון עכבר למינין, | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
| MEM פתרונות חומצות אמינו לא חיוניות (100x) | תוסף ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| N-2 (100 x) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | |
| פולי-L-אורניתין | Merk | P3655 | |
| מערכות מו"פ חלבון רקומביננטי BMP-4 אנושי | 314-BP-010 | ||
| מערכות מו"פ | חלבון רקומביננטי אנושי Wnt-3a | 5036-WN | |
| נתרן פירובט (100 מ"מ) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| מעכב טריפסין פולי סויה, אבקת | Thermo Fisher Scientific | 17075029 | |
| מים | סטריליים נטולי יונים | מערכת סינון | |
| MilliQ Trypsin EDTA (0.25%) | Sigma | T4049-500ML | |
| ציוד לתרבית תאים | |||
| פיפטות נפח מתכווננות 10, 100, 200, 1000 μL | Eppendorf | מטריצת | |
| מוסמכת ESC (Matrigel) | קורנינג | CLS354277-1EA | |
| צנטריפוגה | Hettich צנטריפוגן | רוטינה 420R | 5% CO2, 37 °C |
| אינקובטור | ThermoForma Steri-Cult CO2 | HEPA Class100 | |
| כלי חיתוך תאי גזע 0.190-0.210 מ"מ | Vitrolife | 14601 | |
| צינורות סטריליים | Sarstedt | פיפטות | |
| 150 מ"מ | VWR | 612-1701 | |
| קצות פיפטה סטריליות 0.1-1000 מיקרוליטר | Biotix VWR | ||
| 5, 10, 25, 50 מ"ל | צלוחיות Costar | שונות | |
| T25 Nunc | ThermoFisher Scientific | 156367 |
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה