הזרקה סטריאוטקסית של וירוסים לשינוי גנטי יציב במודל עכבר

תקציר

מקור: Porlan, E., et al. שינוי גנטי יציב ויעיל של תאים בעכבר הבוגר V-SVZ לניתוח השפעות אוטונומיות ולא אוטונומיות של תאי גזע עצביים. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים שינוי גנטי יציב של תאי גזע עצביים (NSCs) באזור הגחון-תת-חדרי (V-SVZ) באמצעות הזרקה סטריאוטקסית של גן טיפולי נושא וירוס במודל עכבר. הנגיף חודר לתאי גזע, עובר שעתוק הפוך, משתלב בגנום ומאפשר שינוי גנטי יציב ויעיל ליישומים נוירותרפיים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הזרקה סטריאוטקסית של החדר הצדדי (LV) לאזור החדר-תת-חדרי (V-SVZ)/גבול הסטריאטום או לתוך הזרקת

1. המיקרו LV של LV
   1. בחר ועקר את הכלים הדרושים לניתוח (אזמל, מקדחה ופינצטה קטנה).
   2. הרדמה של עכבר בן 6-8 שבועות על ידי הזרקה תוך-צפקית (ip) של תערובת בפיקוח וטרינרי של קטמין ומדטומידין. שקלו כל בעל חיים ומינו כל אחד עם 50-75 מ"ג קטמין ו-0.5-1 מ"ג מדטומידין לכל ק"ג משקל גוף של עכבר (בסביבות 100-125 מיקרוליטר של תמיסת הקטמין/מדטומידין לכל עכבר).
   3. העריכו את מישור ההרד....

תוצאות

איור 1: ייצוג סכמטי של החלקים השונים של ההליך. (א) יצירת LVs למחקרי תיוג in vivo, החל מהעברה של תאי כליה עוברית אנושית 293T (HEK293T) עם פלסמידים מתאימים ליצירת ה-LV, ועד לקביעת טיטר הנגיף על ידי זרימה ציטומטרית באמצעות הנוסחה המצוינת. שמות הפלסמידים ורוט.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ציוד:
מכשיר סטריאוטקסי Vernier	NeuroLab,
	KD Scientific	KDS-311-CE 33-gauge
מזרק	המילטון	P/N 84851/00	85RN
מקדחה חשמלית	כלי מדע עדין	98096
שמיכה	תרמית Ufesa	AL5512/01	230-240 V, 100-110 W, סוג C-AL01
מכונת גילוח	Jata	MP373N	דגם: יופי, 3 V, 300 mA, סוג HT-03.
ריאגנטים:
Medetomidine	Esteve	Domtor	תמיסה קומרסיאלית ב-1 מ"ג/מ"ל.
קטמין	מריאל	Imalgene 500	תמיסה קומרסיאלית ב-50 מ"ג/מ"ל
		מדטומידינה/קטמין	הכינו תערובת עובדת של מדטומידין בריכוז סופי של 0.2 מ"ג/מ"ל דילול וקטמין בריכוז סופי של 15 מ"ג/מ"ל בתמיסת מלח. השתמש כהרדמה בהזרקת נפח כדי לקבל ריכוז סופי של 0.5-1 מ"ג מדטומידינה לק"ג משקל גוף ו-50-75 מ"ג קטמין לק"ג משקל גוף
תמיסת Butorphanol	Pfizer	Torbugesic	Stock ב-10 מ"ג/מ"ל. משמש כמשכך כאבים במינון 1 מ"ג/מ"ל בתמיסת מלח.
0.9% תמיסת מלח	בראון	13465412
עט טוש כירורגי	Staedler	313-9	חומר
	לומוקולור Siccafluid	0.5 גרם/דוזיס, קרבומר 974P
פובידון-יוד	בטדין	694109.6	10% פובידון-יוד

מחזיק מזרק Leica 39463001 תערובת סיכה קבוע