הזרקה סטריאוטקסית של וירוסים לשינוי גנטי יציב במודל עכבר

תקציר

מקור: Porlan, E., et al. שינוי גנטי יציב ויעיל של תאים בעכבר הבוגר V-SVZ לניתוח השפעות אוטונומיות ולא אוטונומיות של תאי גזע עצביים. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים שינוי גנטי יציב של תאי גזע עצביים (NSCs) באזור הגחון-תת-חדרי (V-SVZ) באמצעות הזרקה סטריאוטקסית של גן טיפולי נושא וירוס במודל עכבר. הנגיף חודר לתאי גזע, עובר שעתוק הפוך, משתלב בגנום ומאפשר שינוי גנטי יציב ויעיל ליישומים נוירותרפיים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הזרקה סטריאוטקסית של החדר הצדדי (LV) לאזור החדר-תת-חדרי (V-SVZ)/גבול הסטריאטום או לתוך הזרקת

1. המיקרו LV של LV
   1. בחר ועקר את הכלים הדרושים לניתוח (אזמל, מקדחה ופינצטה קטנה).
   2. הרדמה של עכבר בן 6-8 שבועות על ידי הזרקה תוך-צפקית (ip) של תערובת בפיקוח וטרינרי של קטמין ומדטומידין. שקלו כל בעל חיים ומינו כל אחד עם 50-75 מ"ג קטמין ו-0.5-1 מ"ג מדטומידין לכל ק"ג משקל גוף של עכבר (בסביבות 100-125 מיקרוליטר של תמיסת הקטמין/מדטומידין לכל עכבר).
   3. העריכו את מישור ההרדמה על ידי צביטה של אצבעות הרגליים, הזנב או האוזן והקפידו שהחיה לא תראה תגובה.
   4. לאחר הרדמת העכבר, יש להזריק בוטואורפנול תת עורי במינון סופי של 0.4-0.5 מ"ג לק"ג משקל עכבר כדי למזער את הכאב לאחר הניתוח.
   5. לגלח את האזור שבין האוזניים ולחטא את העור באמצעות יודופור כמו יודופובידון או 70% אתנול. יש לנקות באמצעות אפליקטורים סטריליים עם קצה כותנה. היזהר לא להרטיב יתר על המידה את החיה, מכיוון שהדבר עלול להחמיר היפותרמיה.
   6. הנח את החיה במצב נוטה על מסגרת סטריאוטקסית וקבע בזהירות את הראש באמצעות מוטות האוזניים ותמיכת החיך של המנגנון. שמור את העכבר עם כרית חימום מוגדרת ל-37 מעלות צלזיוס ומרח חומר סיכה עיניים על העיניים.
   7. בצע חתך באורך 1 ס"מ על עור הראש לאורך באמצעות אזמל, ומשוך בעדינות את העור כדי לחשוף את הגולגולת באמצעות פינצטה עדינה.
   8. נקו בזהירות את משטח העצם בעזרת אפליקטור סטרילי עם קצה כותנה. נקה את עצם הגולגולת החשופה מכל רקמה שנותרה.
   9. התקן את המזרק המעוקר על המכשיר הסטריאוטקטי באמצעות מחזיק המזרק.
   10. הזז את מחזיק המזרק לאורך צירי x, y ו-z עד שקצה מחט המזרק ממוקם על הברגמה, נקודת החיבור שבה התפר הסגיטלי (האורכי והמדיאלי) נחתך בניצב על ידי התפר העטרתי (איור 1b). ודא שמיקום ה"אפס" של ציר הגב-גחון (DV) נמצא על פני הגולגולת בברגמה.
   11. העבר את המזרק לקואורדינטות היעד x ו-y (ראה טבלה 1 ואיור 1b).
   12. הוסף הערות לקואורדינטות היעד x, y ו-z בסולם ורנייה על מנת שתוכל לחזור לאתר ההזרקה מאוחר יותר. סמן את העצם בקואורדינטות x ו-y באמצעות עט טוש כירורגי.
   13. הרחק את המזרק מאזור העבודה.
   14. בעזרת מקדחה חשמלית, צרו חור בגולגולת בזהירות כדי לא לפגוע במוח. אין לקדוח את משטח הפיאל, מכיוון שהדבר עלול לפגוע במשטח המוח.
   15. טען את המזרק ב-1 מיקרוליטר מתוך התמיסה הנגיפית 10⁶ TU/μl (יחידות מתמר למיקרוליטר). השתמש במחט משופעת חדה בגודל 33 שקצהה בעל זווית של 10-12°. מקם את מחט המזרק בזווית של 90 מעלות ביחס למשטח המוח.
   16. הזיזו את המזרק בחזרה למקום ההזרקה והזיזו אותו כלפי מטה עד שהקצה נוגע במשטח הפיאל.
   17. לחדור למוח עם המזרק לקואורדינטות z בציר ה- DV.
   18. שחררו לאט את התרחיף הנגיפי בקצב של 0.2 מיקרוליטר/דקה על מנת למזער את הנזק לרקמת המוח עקב לחץ נוזלים מוגזם.
   19. המתן 5-10 דקות כדי למזער את הזרימה החוזרת של התרחיף הנגיפי, ולאחר מכן החזר את המזרק לאט מאוד.

אזור ההזרקה	קואורדינטות
	קדמי-אחורי (AP)	מדיו-לטרלי (ML)	דורסו-גחון (DV)
SEZ/גבול סטריאטום	+ 0.6 מ"מ	+ 1.2 מ"מ	- 3.0 מ"מ
חדר לרוחב	- 0.3 מ"מ	+ 1.0 מ"מ	- 2.6 מ"מ

< br />

טבלה 1: קואורדינטות סטריאוטקסיות לזריקות. עבור הצירים הקדמיים-אחוריים (AP) והמדיו-לטרליים (ML), קואורדינטות x ו-y ניתנות כמרחק (במ"מ) מהברגמה. "-" מציין "לכיוון האחורי". עבור קואורדינטות DV, "אפס" הוא פני הגולגולת בנקודת הברגמה, וקואורדינטות DV מציינות את המרחק (במ"מ) למטה מנקודה זו.

תוצאות

איור 1: ייצוג סכמטי של החלקים השונים של ההליך. (א) יצירת LVs למחקרי תיוג in vivo, החל מהעברה של תאי כליה עוברית אנושית 293T (HEK293T) עם פלסמידים מתאימים ליצירת ה-LV, ועד לקביעת טיטר הנגיף על ידי זרימה ציטומטרית באמצעות הנוסחה המצוינת. שמות הפלסמידים ורוט...

חומרים