מניפולציה של תאי צלחת עצבית באמצעות ננו-הזרקה ברחם במודל עכבר עוברי

תקציר

מקור: Mangold, K., H el. al., מיקוד צלחת עצבית של עכברים על ידי הזרקת ננו ברחם (NEPTUNE) ביום העוברי 7.5. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים את שיטת הזרקת הננו ברחם למיקוד צלחת עצבית במודל עכבר עוברי. תמיסה לנטי-ויראלית בעלת טיטר גבוה מוזרקת לחלל מי השפיר, שם היא משתלבת בתאי צלחת עצבית, ומאפשרת מניפולציה גנטית יציבה למחקר נוירו-התפתחותי ויישומים טיפוליים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. זריקות

הערה: כל המכשירים המשמשים בהליך זה עוברים עיקור לפני הניתוח ובין כל עכבר.

1. להרדים את הנקבה הראשונה עם חורים בגודל אידיאלי.
2. הניחו וקבעו את הנקבה על השולחן.
3. יש למרוח ג'ל עיניים על העיניים כדי למנוע התייבשות בקרנית ולהזריק משככי כאבים תת עוריים.
   הערה: משככי כאבים מומלצים: בופרנורפין (0.05-0.1 מ"ג/ק"ג משקל גוף) או פלוניקסין (2.5 מ"ג/ק"ג) או דומה בהתאם לתקנות המקומיות לרווחת בעלי חיים. משככי כאבים פרי-ניתוחיים רב-מודאליים נשמרים עם משככי כאבים מוזרקים ואיזופלורן.
4. הכינו את הבטן התחתונה באופן אספטי על ידי ניגוב במטלית ספוגה בתמיסת כלורהקסידין של 0.5 מ"ג/מ"ל (או דומה) וייבשו את העור. השתמש במספריים כירורגיים כדי לבצע חתך עור אנכי בקו האמצע של 1.5-2.0 ס"מ בבטן התחתונה.
   הערה: הכן את אזור הניתוח בעקבות שגרת חיטוי שאושרה מקומית.
5. הרם את העור בעדינות ושחרר את העור משכבת השריר הבסיסית, כ-1 ס"מ סביב נקודת החתך, כדי להקל על התפירה לאחר הניתוח.
6. בצע חתך קו אמצע אנכי של 1 ס"מ לשכבת השריר.
7. בעזרת זוג מלקחיים, הרימו צד אחד של העור ושכבת השריר, ועם הזוג השני, חפשו את קרני הרחם.
   הערה: הדצידואות מסודרות כמו חרוזים על שרשרת, בעוד שהמעי הוא צינור אחד ארוך ורציף
.
8. בעזרת מלקחיים שולפים בזהירות את שתי קרני הרחם מהבטן. להחזיק את הרקמה בין העוברים; אין לסחוט אותם ישירות (איור 1B).
   הערה: הרחם מחובר לגוף בצוואר הרחם, ושתי השחלות/הביציות מחוברות באמצעות רצועות. אין למשוך/לנתק את הרחם מנקודות העיגון הללו.
9. ספרו ורשמו את מספר העוברים בצד שמאל וימין.
10. מספר את העוברים מהשחלה לצוואר הרחם או מצוואר הרחם לשחלה.
    הערה: זה חשוב במיוחד אם העוברים המוזרקים ייאספו בשלבים עובריים.
11. בעזרת צמר גפן לח, דחף בעדינות את כל העוברים בחזרה לחלל הבטן למעט שלושת הראשונים שיש להזריק.
12. הניחו טיפה של PBS (מי מלח עם חוצץ פוספט) על הגומי בצלחת הפטרי והחזיקו אותה מיד מעל העוברים.
13. הכניסו מלקחיים סגורים לתוך החתך של האלסטי ושחררו את המלקחיים כדי לפתוח את החתך האלסטי כך שהנוזל ייפול על העוברים.
    הערה: זה מבטיח החזרת לחות של העוברים ושהקרום האלסטי נצמד לעור הרטוב של הנקבה, ומונע דליפה של PBS בשלבים הבאים.
14. משוך קטע מהרחם, המתאים לשלושה עוברים, דרך הגומי בעזרת מלקחיים, והושיב בעדינות את צלחת הפטרי על בטן הנקבה.
15. בעזרת המלקחיים ומקלון צמר גפן לח, התאימו את מיקום הרחם ואת הגומי כדי להבטיח שהגומי אטום לעור הנקבה כדי למנוע דליפת PBS.
16. השתמש בארבע רגלי החימר כדי לאבטח ולהדק את צלחת הפטרי מיד מעל הבטן, תוך הפחתת הלחץ על הנקבה ורגישות ההדמיה לנשימה ולפעימות הלב של הנקבה.
17. לחץ על גליל החימר לדוגמנות כלפי מטה מימין לעוברים/רחם כדי לקבע את הרחם (איור 1C).
    הערה: הוראת התמצאות זו מניחה שהמחט נמצאת משמאל לנקבה ושהעוברים של קרן הרחם השמאלית של הנקבה חשופים. צד הרחם (קרן רחם שמאל או ימין) הוא קריטי מכיוון שמי השפיר (AC) פונים למחט (קרן שמאל; איור 1D) או פונה לגליל החימר המייצב (קרן ימין; איור 1E).
18. כדי להזריק עוברים מקרן הרחם הימנית, הניחו את גליל החימר בצד שמאל של העוברים (איור 1F) וסובבו את שולחן החימום ב-180 מעלות (איור 1G) כדי להשיג את הכיוון הנכון. אם ניתן להזיז את המחט במקום זאת, התאם בהתאם להגדרה הרלוונטית.
19. הוסף PBS לצלחת הפטרי עד שהעוברים והרחם מכוסים ב-PBS.
20. הורד את בדיקת האולטרסאונד לתוך PBS והתאם את העכבר/שולחן הניתוח כך שהעובר הראשון מיושר עם בדיקת האולטרסאונד כדי להקל על רישום הזריקות.
    הערה: "ראשון" מתייחס למספור העוברים מהשחלה לצוואר הרחם.
21. סרוק את כל שלושת העוברים ובדוק את המזגנים. קבע את נפח ההזרקה באופן הבא:
    1. מדוד את קוטר ה-AC עם מכונת האולטרסאונד. הזרקו 69 nL אם קוטר ה-AC הוא ≤0.2 מ"מ; הזרקו 2 x 69 nL (= 138 nL) אם קוטר ה-AC הוא >0.2 מ"מ ו-≤0.29 מ"מ; ולהזריק 3 x 69 nL (= 207 nL) אם קוטר ה-AC > 0.29 מ"מ (איור 1H).
       >הערה: ניסויים קודמים הראו כי עד 207 נפחי הזרקה של nL נסבלים היטב ב-E7.5. הזרקות מוצלחות עם השפעה מינימלית על ההישרדות מושגות כאשר עליית הנפח היחסית של ה-AC אינה עולה על 90%. שונות בגודל AC בין חברי המלטה או זני עכברים היא שכיחה ועשויה לדרוש אופטימיזציה נוספת.
22. הגדר את נפחי ההזרקה עם בקר ההזרקה.
23. הגדר את מהירות ההזרקה להאט עם קצב הזרקה של 23 nL/s.
    הערה: דגמי ציוד שונים יכולים לגרום לכוחות הזרקה שונים.
24. הורד את המחט לתוך ה-PBS באמצעות הגלגלים הראשיים במערכת המסילות (מישורי x ו-z, איור 1I) ולחץ על ריק בבקר הננו-מזרק עד שהנוזל יגיע לקצה המחט.
    הערה: אם המחט נסתמה, לחיצה על ריק יכולה להמיס את הסתימה ו/או להוציא את הסתימה.
25. הרם את המחט מה-PBS ולחץ על הזרק. ודא שנפלטת טיפה של הנפח הרצוי המשוער.
26. הורידו את המחט לתוך ה-PBS ויישרו אותה עם בדיקת האולטרסאונד והעובר על ידי הזזת הננו-מזרק עם גלגל מישור ה-y על המיקרומניפולטור (איור 1J).
    הערה: קצה המחט מיושר בצורה מושלמת כאשר הוא מופיע כנקודה בהירה בתמונת האולטרסאונד (איור 1K,L). ניתן להזיז את המחט בכל שלושת מישורי הכיוון עם המיקרומניפולטור.
27. כוונן את זווית המחט עם גלגל זווית ההזרקה כדי להבטיח זווית הזרקה כמעט מאונכת ביחס לדופן הרחם. הכנס את המחט לתוך ה-AC בתנועה אחת באמצעות גלגל ההזרקה במיקרומניפולטור (איור 1J-M). שימו לב לבהירות קצה המחט. אם קצה המחט נעלם מתמונת האולטרסאונד, הזז את בדיקת האולטרסאונד קדימה או אחורה כדי להחזיר את המחט למיקוד.
    הערה: ברגע שהמחט נמצאת בתוך המזגן, ניתן לבצע שינויים קלים במיקום המחט ובמיקוד מבלי לפגוע בעובר (התאמות בטווח של ~0.3 מ"מ). אל תתאים את מיקום המחט יותר מזה.
28. לחץ על הזרקה (עבור 207 nL, הגדר את עוצמת הקול ל-69 nL והזרק שלוש פעמים). לאחר ההזרקה, המתן 5-10 שניות נוספות לפני שתמשוך את המחט בתנועה עדינה אחת.
29. העבירו את השלב לעובר הבא וחזרו על שלבים 1.22-1.26 עבור שני העוברים האחרים אם יש להם גדלי AC מתאימים.
30. הרם את בדיקת האולטרסאונד והמחט מה-PBS באמצעות המיקרומניפולטור. סובב את המחט מהמפעיל כדי למנוע נזק ופציעה.
31. בעזרת מלקחיים, כוונו את העובר הראשון והשני בחזרה לבטן הנקבה על ידי דחיפתם בעדינות דרך הגומייה. אחזו בעדינות ברקמה הסמוכה לעובר השלישי ומשכו את הרחם לכיוון הקצה העליון של החתך האלסטי. משוך בעדינות את העוברים הרביעי-שישי בעזרת מלקחיים ואפשר לעובר השלישי להיכנס שוב לבטן.
    הערה: ניתן לבצע שלב זה מבלי לשנות את ה-PBS או להסיר את צלחת הפטרי.
32. חזור על הפעולה לפי הצורך עד להזרקת כל העוברים עם ACs אופטימליים או הגעה למגבלת הזמן.
33. דחף בעדינות את העוברים/הרחם בחזרה לבטן הנקבה.
34. שאפו את ה-PBS והוציאו את צלחת הפטרי. אם נעשה שימוש בנגיף, טפל בו כפסולת זיהומית.
35. תפר יחד את שכבת השרירים עם ויקריל (USP 6-0, אורך מחט 13 מ"מ, 3/8 עיגול) בתפרים רציפים או קטועים פשוטים וסגור את העור עם 1-2 קליפסים (ראה טבלת החומרים).
36. כבה את משאבת האיזופלורן.
37. הסר את סרט הניתוח והנח את הנקבה במצב שכיבה (בטן למטה) בכלוב נקי על צלחת חימום של 40 מעלות צלזיוס.
    הערה: הנקבה צפויה לחזור להכרה ולהיות ניידת תוך 10 דקות. ודא שההליך הושלם תוך 30 דקות. הרקע הגנטי, הגיל והמשקל של הנקבה עשויים להשפיע על הרגישות להרדמה. עקוב אחר העכברים במהלך הניתוח לאיתור סימנים של נשימה איטית (נשימה איטית פירושה שההרדמה עמוקה מדי) או תנועה (ההרדמה קלה מדי). ניתן לספק בופרנורפין (0.05-0.1 מ"ג/ק"ג משקל גוף) או פלוניקסין (2.5 מ"ג/ק"ג) או דומה, בהתאם לתקנות רווחת בעלי החיים המקומיות, 8 שעות לאחר הזריקה הראשונה במידת הצורך.
38. אם יש להזריק נקבה נוספת, הכינו את אזור הניתוח תוך מעקב אחר התעוררות הראשונה.
    1. נגב את כלי הניתוח עם 70% אתנול כדי להסיר שאריות דם או רקמה ולעקר אותם במעקר חרוזי הזכוכית שחומם מראש למשך 10 שניות. נגב את צלחת הפטרי וחתיכות החימר יבשות בנייר טישו.
39. חזור על שלבים 1.1-1.35 עד שכל הנקבות יוזרקו.
40. רוקנו והשליכו את המחט.
    1. אם נשאר וירוס או תמיסת הזרקה במחט, לחץ על רוקן על הננו-מזרק ורוקן את תוכן המחט על נייר טישו.
    2. משוך את בוכנת המתכת לחלוטין על ידי לחיצה על מילוי עד שיישמע צפצוף כפול מהבקר, מה שמעיד על כך שהבוכנה נסוגה לחלוטין.
    3. שחרר את הקולט והחלק את המחט מהבוכנת המתכת. השליכו את המחט למיכל הפסולת החדה.
41. נקה את ספסל BSL-2 (רמת בטיחות ביולוגית 2).
    1. אם נעשה שימוש בווירוס, יש לרסס את כל שדה הניתוח בחומר חיטוי (ראה טבלת החומרים). לאחר 15 דקות יש לנגב את חומר החיטוי ולנקות את כל שדה הניתוח עם 70% אתנול. אם לא נעשה שימוש בנגיף, נקה את כל המשטחים עם 70% אתנול.
    2. נגב את כל ה-PBS שנותר מבדיקת האולטרסאונד עם נייר טישו יבש, רך ונטול מוך.
42. השלך פסולת בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית.
43. כבה את מכונת האולטרסאונד, שולחן החימום, ספסל BSL2 ואספקת O₂.

תוצאות

איור 1: גודל וכיוון אופטימליים של חלל מי השפיר להזרקות מוצלחות. (א) קרן רחם עם מספר E7.5 deciduas, בצורת מחרוזת כדורים (למטה) בהשוואה למעי הגס (למעלה). (B) תפסו את רקמת הרחם (קווים מקווקוים לבנים) בין הדצידואה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1 mL מזרק	BD Bioscience	309628
27 G Needle	BD Bioscience	300635
3.5 אינץ' נימים	Drummond Scientific	3000203G/X	שימשו למשיכת מחטי בית
מתמר מסדרת MS 70 מגה-הרץ	Visual Sonics	MS700
Aquasonic ג'ל אולטרסאונד שקוף	Parker Laboratories	Mar-50
Autoclip Applier 9 מ"מ	Angthos	12020-09
CD1 עכברים	צ'ארלס ריבר, גרמניה	Crl:CD1(ICR)	נקבות: מגיל 8 שבועותזכרים: מגיל 12 שבועות
צמר גפן	OneMed Sverige AB	120788
DPBS	Gibco	14190094
מלקחיים חבישה עדינים ישר 13 ס"מ	Agnthos	08-032-130
EZ קליפסים 9 מ"מ	Angthos	59027	קליפסים
מספריים לאיריס, סופר קאט, ישר, 9 ס"מ	Agnthos	307-336-090
איזופלואורן	בקסטר רפואי AB	EAN: 50085412586613	נרכש מבית המרקחת השוודי
Kimwipes Kimwipes Kimberly	Clarke	7557
סרט ממברנה	Visual Sonics	SA-11053
Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Modeling Clay	Sense AB	10209
שולחן טיפול בעכבר	Visual Sonics	50249
Nanoject II ערכת מזרק אוטומטי	Drummond	3-000-205A
Parafilm	Bemis	HS234526C
צלחת פטרי עם פתח מרכזי (קיר נמוך)	Visual Sonics	SA-11620
צלחת פטרי, (ØxH): 92 x 16 מ"מ	Sarstedt	82.1472.001
Reli+On Virkon	DuPont	130000132037	חומר חיטוי
קרום סיליקון	Visual Sonics	SA-11054
Steri 250, מעקר חרוזים חמים	Angthos	31100
סרט כירורגי (1.25 ס"מ x 9.14 מ')	Medicarrier	67034
Vevo Compact Dual (Med. Air & O2) מערכת הרדמה	Visual Sonics	VS-12055
Vevo תחנת הדמיה 2	Visual Sonics	VS-11983
Vevo2100	Visual Sonics	VS-20047
Vicryl 6-0; מחט C-3, נימה סגולה 45 ס"מ	Agnthos	J384H