העברת גנים לתאי שוואן של העצב הסיאטי של המכרסם באמצעות אלקטרופורציה

תקציר

מקור: Ino, D. et al., העברת גנים in vivo לתאי שוואן בעצב הסיאטי של המכרסמים על ידי אלקטרופורציה. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים העברת גנים in vivo לתאי שוואן של העצב הסיאטי של המכרסם באמצעות אלקטרופורציה. תמיסת צבע DNA פלסמיד מוזרקת לעצב, ופולסים חשמליים מקלים על כניסת ה-DNA. ה-DNA משתלב מאוחר יותר בגנום התא, ומאפשר העברת גנים מוצלחת בתאי שוואן.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הכנת DNA פלסמיד

1. צור פלסמידים של DNA עבור אלקטרופורציה in vivo על ידי שיבוט ה-DNA המשלים (cDNA) או רצף RNA סיכת ראש קצר (shRNA) לפלסמיד ביטוי לתאי יונקים. השתמש במשפר מוקדם מיידי של ציטומגלווירוס ובפלסמיד מונע על ידי מקדם β-אקטין (CAG) מכיוון שהוא מאפשר ביטוי חזק ויציב. לביטוי של shRNAs בשליטת מקדם CAG, השתמש במערכת קלטות shRNA מבוססת mir30 לשיבוט משנה של ה-shRNA.
2. טהר את ה-DNA של הפלסמיד עם ערכת הכנה מקסימלית בהתאם להוראות היצרן, והשהה מחדש את ה-DNA עם תמיסת מלח חוצצת HEPES (140 מ"מ נתרן כלורי, NaCl, 0.75 מ"מ די-נתרן מימן פוספט, Na₂HPO₄, 25 מ"מ 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזינאתי-חומצה סולפונית (HEPES); pH 7.40). התאם את ריכוז ה-DNA ל-≥4 מיקרוגרם/מיקרוליטר.
3. הכן את תמיסת ה-DNA של הפלסמיד לריכוז של 4 מיקרוגרם/מיקרוליטר, והוסף כמות מינימלית של צבע ירוק מהיר (ריכוז סופי של 0.01%) כדי לסמן את אתר ההזרקה. כאשר נדרשת אלקטרופורציה בו זמנית של מספר פלסמידים, התאם את הריכוז הכולל של תמיסת ה-DNA של הפלסמיד ל-4 מיקרוגרם/מיקרוליטר.
   הערה: יש לקבוע את ההרכב האופטימלי של DNA פלסמיד בהתאם ליעילות הטרנספקציה של כל פלסמיד.

2. עיקור מכשירים כירורגיים ומכשירים

1. כירורגיים לחיטוי מי מלח ותמיסת NaCl 0.9%.

3. הכנת

1. פיפטות הזכוכית של מיקרופיפטה משוך פיפטות זכוכית באמצעות מושך פיפטה. חותכים את קצה הפיפטה לקוטר של 30-50 מיקרומטר. השתמש בפרמטרים הבאים: חום, 600; מהירות, 50; זמן, 75.

4. כירורגיה של בעלי חיים, הזרקת דנ"א ואלקטרופורציה

הערה: סקירה כללית של שלב זה מתוארת באיור 1. למרות שההליך לגורי חולדות מתואר כאן, השיטה ישימה גם לבעלי חיים בוגרים יותר המשתמשים באותו הליך.

1. הרדמו את החולדה עם איזופלורן בתיבת האינדוקציה עד שהחיה הופכת לחסרת תנועה על ידי התאמת זרימת החמצן ל-0.4 ליטר לדקה וריכוז האיזופלורן ל-4% (נפח/נפח). בצע צביטה בבוהן כדי לאשר הרדמה נכונה.
2. הניחו את החולדה על המחמם שחומם מראש תחת מיקרוסקופ דו-עיני ושמרו על הרדמה על ידי מתן איזופלורן באופן רציף דרך מסכת הפנים. התאם את זרימת החמצן ל-0.2 ליטר לדקה ואת ריכוז האיזופלורן ל-2% (נפח/נפח). השתמש בטיפות עיניים כדי למנוע יובש בעיניים אם עיני החיה פקוחות.
3. תקן את הרגליים בעזרת סרט כירורגי.
4. נקו את העור בירך האחורית עם פובידון-יוד ובצעו חתך בעזרת אזמל
   הערה: גלחו אזורים כירורגיים אם הם מכוסים בשיער.
5. חשוף את העצב הסיאטי על ידי יצירת פתח בין שריר הירך הארבע ראשי לשריר הזרוע עם מחטי תפירה.
6. הרטיבו את העצב בתמיסת NaCl של 0.9%. ספוג עודפי מים עם נייר נטול מוך.
7. הכנס את הבסיס של מיקרופיפטה מזכוכית על צינורות גמישים, ומלא את הכמות המספקת של תמיסת DNA (לפחות מיקרוליטר אחד) לתוך המיקרופיפטה על ידי שאיבה עדינה.
8. הרם את העצב החשוף על ידי משיכה עדינה של הצד הדיסטלי של העצב באמצעות מחט.
   הערה: אל תפעיל מתח על העצב כדי למזער לחץ מכני.
9. הכניסו את המיקרופיפטה מזכוכית לאתר הדיסטלי על העצב, והזריקו את תמיסת הדנ"א על ידי הפעלת לחץ (כלומר על ידי נשיפה לתוך הקצה הפתוח של הצינור הגמיש). הזרקת תמיסת DNA עד שהעצב נראה ירוק (מקסימום 1 מיקרוליטר ). מכיוון שהחדרה תכופה של המיקרופיפטה עלולה לפגוע בעצב, אל תכניסו את המיקרופיפטה יותר מפעמיים.
10. הניחו אלקטרודת פלטינה מסוג פינצטה במרחק של כ-1-2 מ"מ מהעצב. מלא את הפער בין האלקטרודה לעצב בתמיסת NaCl של 0.9%.
    הערה: אל תחזיק את העצב עם האלקטרודה כדי למנוע לחץ מכני על העצב.
11. החל פולסים חשמליים על אתר ההזרקה באמצעות אלקטרופורטור עם האלקטרודה. לאחר הגדרת הדופק הראשונה, הפוך את האלקטרודה והחל סט דופק נוסף. השתמש בפרמטרים הבאים: מתח, 50 וולט; משך דופק, 5 מילי-שניות; מרווח דופק, 100 מילי-שניות; מספר דופק, פי 4.
12. נקה את אתר האלקטרופורציה עם תמיסת NaCl 0.9%.

5. לאחר אלקטרופורציה

1. סגור את החתכים עם דבק ציאנואקרילט.
2. לאחר ייבוש הדבק יש לנקות את הפצע עם פובידון-יוד.
3. שחרר את הגור ממסכת הפנים. חממו את הגור על מחמם למשך שעה לפחות על מנת לאפשר לו להתאושש לחלוטין מההרדמה.

תוצאות

איור 1: סכמטי של שיטת האלקטרופורציה in vivo. ראשית, העצב הסיאטי של החולדה המורדמת נחשף. שנית, DNA פלסמיד מוזרק לעצב הסיאטי. שלישית, פולסים חשמליים מועברים לאתר ההזרקה דרך האלקטרודה בצורת מלקחיים. לבסוף, הפצע נסגר בדבק. ניתן לחזור על הליך זה על העצב הנגדי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Genopure plasmid Maxi kit	Roche	03 143 422 001	ערכת טיהור DNA פלסמיד
Fast Green CFC	WAKO	069-00032	צבע להזרקת DNA
GC 150T-10	מכשיר הרווארד	30-0062	זכוכית
צינורות יניקה	Drummond	05-2000-00	צינורות יניקה להזרקת מיקרו
דגם P-97	SUTTER INSTRUMENT CO.	חולץ מיקרופיפטה
CUY21 תא יחיד	BEX	אלקטרופורטור CUY21	מחולל דופק
מחמם חשמלי	KODEN	CAH-6A	מחמם במהלך הניתוח
איזופלואולן	מיילן	1119701G1076	חומר הרדמה

נימיים תא יחיד