אספקה מתמשכת של גורם גדילה עצבי באמצעות סרט סיליקון נקבובי בתאי Pheochromocytoma 12 של חולדה

תקציר

מקור: Rosenberg, M., et al. תכנון סרטי סיליקון נקבוביים כנשאים של גורם גדילה עצבי. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים את השימוש בסרט סיליקון נקבובי ננו-מובנה מתכלה (PSi) לשחרור מתמשך של גורם גדילה עצבי (NGF) כדי לתמוך בהתמיינות תאי PC12. NGF נספג על נקבוביות הסרט באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות ומשתחרר בהדרגה למדיה על ידי דיפוזיה ופירוק פיגומים. אספקה מבוקרת זו מקדמת את הישרדות תאי PC12 ומקלה על צמיחה והסתעפות של נויריטים לאורך תקופה ממושכת.

פרוטוקול

1. ייצור של נושאי סיליקון נקבובי מחומצן (PSiO₂)

1. חותכים פרוסת סיליקון (Si) (צד יחיד מלוטש על הפנים <100> ומסומם בכבדות בורון, סוג p, 0.95 mΩ·ס"מ) לדגימות של 1.5 ס"מ × 1.5 ס"מ באמצעות עט עם קצה יהלום.
2. חמצן את דגימות ה-Si בתנור צינור ב-400 מעלות צלזיוס למשך שעתיים באוויר הסביבה (קצב חימום: 25 מעלות צלזיוס לדקה, קירור טבעי).
3. טבלו את דגימות ה-Si בתמיסה של חומצה הידרופלואורית מימית (HF) (48%), מים מזוקקים כפולים (ddH₂O) ואתנול (99.9%) (1:1:3 v/v/v) למשך 5 דקות; לאחר מכן שטפו את הדגימות באתנול שלוש פעמים וייבשו תחת זרם חנקן.
   הערה: הכינו ואחסנו תמיסת HF בכלי פלסטיק בלבד, מכיוון ש-HF ממיס זכוכית.
   זהירותHF הוא נוזל מאכל מאוד, ויש לטפל בו בזהירות רבה.: במקרה של חשיפה יש לשטוף היטב במים ולטפל באזור הפגוע בג'ל נוגדן HF; פנה מיד לטיפול רפואי.
4. הרכיבו את דגימת ה-Si בתא תחריט פוליטטרפלואורואתילן, תוך שימוש ברצועת רדיד אלומיניום כמגע אחורי וסליל פלטינה כאלקטרודת הנגד.
5. חרוט שכבת קורבן בתמיסה של 3:1 (v/v) של HF ואתנול מימי (99.9%) למשך 30 שניות בצפיפות זרם קבועה של 250 mA/^cm2; לאחר מכן שטוף את פני השטח של סרט ה-PSI המתקבל באתנול שלוש פעמים וייבש תחת זרם חנקן.
6. ממיסים את השכבה הנקבובית הטרייה שנחרטה בתמיסת נתרן הידרוקסיד מימית (NaOH) (0.1 מ') למשך 2 דקות. לאחר מכן, יש לשטוף באתנול שלוש פעמים ולייבש תחת זרם חנקן.
7. טבלו את הדגימה בתמיסה של HF מימי (48%), ddH₂O ואתנול (99.9%) (1:1:3 v/v) למשך 2 דקות. לאחר מכן, יש לשטוף באתנול שלוש פעמים ולייבש תחת זרם חנקן.
8. חרטו אלקטרוכימית את דגימת ה-Si בתמיסה של 3:1 (v/v) של HF מימי ואתנול (99.9%) למשך 20 שניות בצפיפות זרם קבועה של 250 mA/cm²; ואז שטפו את פני השטח של סרט ה-PSI המתקבל באתנול שלוש פעמים וייבשו תחת זרם חנקן.
9. חמצנו תרמית את דגימות ה-PSi הטריות שנחרטו בתנור צינור בטמפרטורה של 800 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת באוויר הסביבה (קצב חימום: 25 מעלות צלזיוס/דקה, קירור טבעי) ליצירת פיגום SiO₂ (PSiO₂) נקבובי.
10. סובבו את דגימות ה-PSiO₂ עם פוטו-רזיסט עבה פוזיטיבי ב-4,000 סל"ד למשך דקה אחת; לאחר מכן אפו את הדגימות המצופות ב-90°C למשך 2 דקות (קצב חימום: 5°C/min, קירור טבעי).
11. קוביות את דגימות ה-PSiO₂ לדגימות של 8 מ"מ ×-8 מ"מ באמצעות מסור חיתוך.
12. כדי להסיר את הפוטו-רזיסט, יש להשרות את הדגימות החתוכות לקוביות באצטון למשך 3 שעות; לאחר מכן לשטוף היטב באתנול ולייבש תחת זרם חנקן.

2. טעינת PSiO₂ עם גורם גדילה עצבי (NGF)

1. כדי להכין את תמיסת הטעינה של NGF, ממיסים 20 מיקרוגרם של עכברים β-NGF ב-400 מיקרוליטר של תמיסה של 1:1 (v/v) של 0.01 M מלח חוצץ פוספט (PBS) ו-ddH₂O.
2. הוסף 52 מיקרוליטר מתמיסת הטעינה על גבי דגימת ה-PSiO₂ ודגירה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר (RT) בכלי מכוסה.
   הערה: שמור על לחות גבוהה בכלי כדי למנוע מהתמיסה להתייבש במהלך הדגירה.
3. אסוף את התמיסה על גבי הדגימה לכימות עוקב של תכולת ה-NGF בתוך נושא ה-PSiO₂.
   הערה: טעינת NGF ל-PSiO₂ צריכה להתבצע מיד לפני השימוש המיועד; לא ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן עקב הסיכון לייבוש ודנטורציה של החלבון.

3. כדאיות וצמיחה של תאים בנוכחות נשאי PSiO₂ טעונים ב-NGF

1. תרבית תאים של פאוכרומוציטומה של חולדה (PC12)
   1. הכן את מצע הגידול הבסיסי על ידי הוספת 10% סרום סוסים (HS), 5% סרום בקר עוברי (FBS), 1% L-גלוטמין, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-0.2% אמפוטריצין למדיום המכון הרפואי רוזל פארק (RPMI).
   2. הכן מדיום התמיינות על ידי הוספת 1% HS, 1% L-גלוטמין, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-0.2% אמפוטריצין למדיום RPMI.
   3. תרחיף תאים לגדל (10⁶ תאים) בבקבוק תרבית^בגודל 75 ס"מ עם 10 מ"ל מצע גידול בסיסי למשך 8 ימים; כל יומיים יש להוסיף 10 מ"ל של מצע גידול בסיסי לבקבוק.
   4. כדי ליצור תרבית תאי PC12 מובחנת, העבירו את תרחיף התא לצינור צנטריפוגה; תאי צנטריפוגה למשך 8 דקות ב-200 x g ו-RT. השליכו את הסופרנטנט.
   5. השעו את התאים ב-5 מ"ל של מצע גידול בסיסי טרי וצנטריפוגה מחדש של התאים למשך 5 דקות ב-200 x גרם ו-RT; השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא ב-3 מ"ל של מצע גידול בסיסי.
   6. כדי להפריד אשכולות תאים, שאפו את התאים עשר פעמים באמצעות מזרק 23 גרם.
   7. ספרו את התאים באמצעות מונה תאי המוציטומטר וזרע 10⁴ תאים/ס"מ² שטח עבודה על צלחות מצופות קולגן מסוג I בנוכחות מדיום התמיינות.
   8. לאחר 24 שעות, הוסף עכברים טריים β-NGF (50 ננוגרם/מ"ל) או נושא PSiO₂ טעון NGF לכל צלחת.
      >הערה: לריכוזי NGF גבוהים יותר (>50 ננוגרם/מ"ל) יש את ההשפעה המדויקת כמו הריכוז שצוין.
   9. חדש את אמצעי הבידול כל יומיים.
   10. כדי להעריך את כדאיות התא, הוסף 10% (v/v) מתמיסת מחוון הכדאיות (מבוסס רזזורין) בנקודות זמן מייצגות ודגירה למשך 5 שעות ב-37 מעלות צלזיוס; מדוד את הספיגה ב-490 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Acetone	Gadot	830101375
Amphotericin	Biological Industries	03-028-1B
Aqueous HF (48%)	Merck	101513
AZ4533 photoresist	מטאל כימיה בע"מ	AZ4533
BSA fraction v	MP biomedicals	216006950
תמיסת BSA (10%)	תעשיות ביולוגיות	03-010-1B
קולגן מסוג l	קורנינג בע"מ.
קולגנאז	Enco	LS004176
כיסויי פלסטיק מצופים קולגן	NUNC Thermanox	1059846
D-(+)-גלוקוז	Sigma-Aldrich Chemicals	G8170
Dispase-II	Sigma-Aldrich	Chemicals 4942078001
אתנול מוחלט (99.9%)	Merck	818760
FBS	תעשיות ביולוגיות	04-121-1A
גואנידין-HCl	סיגמא-אולדריץ' כימיקלים	G7294
תערובת חומרים מזינים F-12 של חזיר	Thermo Scientific	11765054
HBSS	Thermo Scientific	14185-045
HEPES (1M)	Thermo Scientific	15630-056
HS	תעשיות ביולוגיות	04-124-1A
L-15 בינוני	סיגמא-אולדריץ' כימיקלים	L5520
למינין	תרמו סיינטיפיק	23017015
ל-גלוטמין	תעשיות ביולוגיות	03-020-1A
עכברים β-NGF	פפרוטק	450-34-20
חמור רגיל סרום (NDS)	Sigma-Aldrich Chemicals	G9023
Papain	Sigma-Aldrich Chemicals	p-4762
PBS (pH 7.4)			מוכן על ידי המסה של 10 מ"מ Na₂HPO₄, 1.8 מ"מ KH₂PO₄, 137 מ"מ NaCl ו-2.7 מ"מ KCl במים מזוקקים כפולים (ddH₂O, 18 MΩ·cm).
PBS X10	תעשיות ביולוגיות	02-020-1A
קו תאים PC12	ATCC	CRL-1721
פניצילין-סטרפטומיצין	תעשיות ביולוגיות	03-032-1B
פולי-L-ליזין	סיגמא-אולדריץ' כימיקלים	P4832
מגיב PrestoBlue	תרמו סיינטיפיק	A13261
RPMI בינוני	תעשיות ביולוגיות	01-100-1A
Si פרוסות	Siltronix Corp.		מסומם B-מאוד, סוג p, התנגדות של 0.00095 Ω-ס"מ, <100> אוריינטציה
נתרן אזיד	סיגמא-אולדריץ' כימיקלים	S2002
נתרן הידרוקסיד (NaOH)	Sigma-Aldrich Chemicals	S8045
חומצה טאנית	Sigma-Aldrich כימיקלים	403040
Triton X-100	Chem-Impex International Inc.	1279

354236