ביטוי גנים באמצעות אלקטרופורציה של תא בודד בתרביות פרוסות היפוקמפוס של עכברים

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. הכנת תרבית פרוסות

1. הכן תרביות פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות של עכבר כפי שתואר קודם לכן, באמצעות עכברים בני 6 עד 7 ימים לאחר הלידה משני המינים.
   1. הכן אמצעי דיסקציה לתרבית פרוסות אורגנוטיפיות המורכבות (במ"מ): 238 סוכרוז, 2.5 KCl, 1 CaCl₂, 4 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄ ו-11 גלוקוז במים נטולי יונים, ואז גז עם 5% CO₂/95% O₂ ל-pH של 7.4.
   2. הכן מצע תרבית פרוסות אורגנוטיפי המורכב מ: 78.8% (v/v) מינימום חיוני בינוני נשר, 20% (v/v) סרום סוסים, 17.9 מ"מ NaHCO₃, 26.6 מ"מ גלוקוז, 2 M CaCl₂, 2 M MgSO₄, 30 מ"מ 4-(2-הידרוקסיאתיל) פיפרזין-1-חומצה אתנסולפונית (HEPES), אינסולין (1 מיקרוגרם/מ"ל), ו-0.06 מ"מ חומצה אסקורבית, pH מותאם ל-7.3. התאם את האוסמולריות ל 310-330 אוסמול באמצעות אוסמומטר.
   3. נתחו את ההיפוקמפוס מכל המוח באמצעות שתי מרית, ופרסו (400 מיקרומטר) באמצעות קוצץ רקמות. הפרד פרוסות באמצעות שני מלקחיים והעביר לתוספות תרבית תאים בגודל 30 מ"מ בצלחת 6 בארות מלאה במצע תרבית (950 מיקרוליטר) מתחת לתוספות.
2. אחסן תרביות פרוסות אורגנוטיפיות באינקובטור תרבית רקמה (35 מעלות צלזיוס, 5% CO₂) והחלף את מצע תרבית הפרוסות כל יומיים.

2. הכנת פלסמיד

1. הכן את הפלסמיד לגן המעניין.
   1. שכפל את הגן של החלבון הפלואורסצנטי הירוק המשופר (EGFP) לווקטור pCAG.
   2. טהר את הפלסמיד pCAG-EGFP עם ערכת טיהור נטולת אנדוטוקסין והמיס בתמיסה פנימית המורכבת ממים שטופלו בפירוקרבונט דיאתיל המכילים 140 מ"מ K-מתאן סולפונט, 0.2 מ"מ אתילן גליקול חומצה טטראצטית (EGTA), 2 מ"מ MgCl₂ ו-10 מ"מ HEPES, מותאם ל-pH 7.3 עם KOH (ריכוז פלסמיד: 0.1 מיקרוגרם/מיקרוליטר).

3. הכנת פיפטות זכוכית

1. משוך פיפטות זכוכית בורוסיליקט (4.5 - 8 MΩ) על מושך מיקרופיפטה (איור 1A).
   הערה: פיפטות הזכוכית המשמשות לתיקון תא שלם clamp הקלטות אידיאליות לאלקטרופורציה.
2. אופים פיפטות זכוכית למשך הלילה בחום של 200 מעלות צלזיוס לעיקור.
3. בדוק את גודל קצה הפיפטה תחת מיקרוסקופ דיסקציה כדי להעריך את ההתנגדות החשמלית.
   1. אופציונלי:ודא את התנגדות הפיפטה על ידי הצמדת הפיפטה לאלקטרודה האלקטרופורציונית והשתמש במיקרומניפולטור כדי לתמרן את קצה הפיפטה לנוזל מוחי שדרה מלאכותי מעוקר מסנן (aCSF) המכיל (במ"מ): 119 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl₂, 5 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄ ו-11 גלוקוז במים נטולי יונים, בגז עם 5% CO₂/95% O₂ עד pH של 7.4. אשר את ההתנגדות בפועל באמצעות הקריאה באלקטרופורטור.
      הערה: ככל שקצה הפיפטה חד יותר, כך ההתנגדות החשמלית גדולה יותר. התנגדות הפיפטה צריכה להיות מתחת ל-10 MΩ. פיפטות זכוכית עם התנגדות גבוהה לפיפטה (איור 1B) נסתמות לעתים קרובות בקצה במהלך אלקטרופורציה חוזרת ונשנית.

4. הגדרת אסדת אלקטרופורציה

1. התקן את האלקטרופורטור במתקן אלקטרופיזיולוגיה סטנדרטי של תא שלם, מצויד במיקרוסקופ זקוף המותקן על שולחן הזזה, מיקרומניפולטור ומשאבה פריסטלטית.
2. התקן את שלב הראש של האלקטרופורטור על מיקרומניפולטור וחבר זוג רמקולים לאלקטרופורטור. חבר את האלקטרופורטור לדוושת רגל שניתן להשתמש בה כדי לשלוח דופק כשהוא מוכן.
   הערה: הרמקולים פולטים צליל כאשר הם מופעלים, המהווה אינדיקטור להתנגדות החשמלית באלקטרודה. זה מאפשר לקבוע שינויים יחסיים בהתנגדות מבלי להסיט את תשומת הלב מההליך.

5. הכנת אלקטרופורציה

1. מעבירים תוספות תרבית פרוסות מצלחות 6 בארות לצלחות פטרי בגודל 3 ס"מ עמוסות ב-900 מיקרוליטר של אמצעי תרבית ומאוחסנות בחממת CO₂ על השולחן עד שהן מוכנות לביצוע אלקטרופורציה.
   1. דגירה מוקדמת של תרבית טרייה עם מצע תרבית פרוסות (1 מ"ל) למשך 30 דקות לפחות בצלחת פטרי בגודל 3.5 ס"מ לתרבית פרוסות לאחר אלקטרופורציה.
2. נקו והכינו את האסדה לאלקטרופורציה.
   1. טשטש את הקווים עם 10% אקונומיקה למשך 5 דקות כדי לעקר את הצינור והתא לפני תחילת הניסוי לאותו יום.
   2. יש לטשטף את הקווים במים נטולי יונים למשך 30 דקות לפחות לשטיפה מלאה.
   3. לחלחל את הקווים עם aCSF מעוקר מסנן המכיל 0.001 מ"מ טטרודוטוקסין (TTX).
      הערה: TTX ממזער רעילות תאית ומוות עקב עירור יתר של אינטרנוירונים.
3. הגדר את פרמטרי הדופק של האלקטרופורטור: משרעת של 5 וולט, דופק מרובע, רכבת של 500 אלפיות השנייה, תדר של 50 הרץ ורוחב דופק של 500 מיקרון.
4. מלאו את פיפטת הזכוכית ב-5 מיקרוליטר של תמיסה פנימית המכילה פלסמיד.
   1. הסר את כל בועות האוויר הכלואות מקצה הפיפטה על ידי החלקה והקשה עדינה על הקצה מספר פעמים.
   2. בדוק את הקצה לאיתור נזק על ידי הדמיה שלו תחת מיקרוסקופ דיסקציה או על ידי חזרה על שלב 3.3.1 כדי לבדוק את התנגדות הפיפטה.
      הערה: אם הקצה פגום, יש להשליך את פיפטת הזכוכית, ויש לחזור על שלב זה עם פיפטת זכוכית חדשה שהוכנה בעבר בשלב 3.
5. חבר היטב את קצה הפיפטה לאלקטרודה והפעל את הרמקולים. רשום את הקריאה (התנגדות הפיפטה) של האלקטרופורטור כאשר הקצה יצר מגע עם מדיום ה-aCSF.
6. חותכים את קרום הכנסת התרבות בעזרת להב חד ומבודדים פרוסת תרבות אחת. העבירו בזהירות את תרבית הפרוסות לתא האלקטרופורציה באמצעות מלקחיים בעלי זווית חדה וקבעו את מיקומה בעזרת עוגן פרוסה.
   1. אל תשמור את תרבית הפרוסות מחוץ לחממה יותר מ-30 דקות בכל פעם כדי למנוע תופעות לוואי כגון שינויים בבריאות או בתפקוד העצבים.

6. תאים אלקטרופורטיים מעניינים

1. הפעל לחץ חיובי על הפיפטה בפה או באמצעות מזרק של 1 מ"ל (לחץ של 0.2 - 0.5 מ"ל) המחובר לצינור.
2. השתמש בפקדי הכפתור התלת-ממדיים של המיקרומניפולטור כדי לתמרן את קצה הפיפטה ליד פני השטח של תרבית הפרוסות.
3. בחרו תא מטרה והתקרבו אליו, תוך שמירה על הלחץ החיובי המופעל עד שנוצרת גומה על פני התא הנראית במיקרוסקופ.
4. בצע מחזורי לחץ.
   1. הפעל במהירות לחץ שלילי קל דרך הפה כך שייווצר אטימה רופפת בין קצה הפיפטה לקרום הפלזמה, המסומן ויזואלית על ידי הממברנה העולה מעט לקצה הפיפטה. שימו לב לעלייה (~פי 2.5 מההתנגדות הראשונית) בהתנגדות הפיפטה על ידי האזנה לעלייה בטון שמגיע מהרמקולים. הפעל מחדש במהירות לחץ חיובי כך שהגומה תיווצר מחדש.
   2. השלם מיד לפחות שני מחזורי לחץ נוספים ללא הפסקה, ולאחר מכן החזק לחץ שלילי למשך 1 שניות
      הערה: השהיה בין מחזורים, הפעלת לחץ רב מדי או החזקת הלחץ השלילי זמן רב מדי עלולה לגרום לנזק משמעותי לתאים ואולי לגרום לתא למות במהלך אלקטרופורציה.
5. דופק במהירות את האלקטרופורטור פעם אחת באמצעות דוושת הרגל כאשר הצליל מהרמקולים מגיע לקודקוד יציב בגובה הצליל, מה שמעיד על התנגדות חשמלית שיא. אל תחכה בשיא ההתנגדות יותר משנייה אחת לפני שליחת הדופק.
   הערה: לא צפינו באלקטרופורציה מחוץ למטרה בעת שימוש בפרוטוקול זה. רק התאים שבאו במגע עם פיפטת הזכוכית במהלך מחזורי הלחץ הועברו טרנספקציה. מיקום הפיפטה ליד נוירונים אחרים אינו מביא לטרנספקציה של גנים.
6. משוך בעדינות את הפיפטה כ-100 מיקרומטר מהתא מבלי להפעיל לחץ.
7. הפעל שוב לחץ חיובי, וודא שההתנגדות דומה לקריאה המוקלטת בשלב 5.5, ולאחר מכן התקרב לתא הבא.
   >
   1. הסר סתימות פוטנציאליות, המסומנות חזותית או על ידי התנגדות פיפטה מוגברת משמעותית (>15% יותר) לאחר אלקטרופורציה, על ידי הפעלת לחץ חיובי.
      >הערה: אם אין סתימה גלויה וההתנגדות עדיין גבוהה משמעותית, השליכו את הפיפטה והשתמשו בחדשה. בממוצע, ניתן להשתמש בפיפטה לעד 20 אירועי אלקטרופורציה אם המשתמש זהיר.
8. לאחר האלקטרופורציה, העבירו את תרבית הפרוסות לתוספת תרבית טרייה, ודגרו בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס בחממה עד 3 ימים.

איור 1: שתי תמונות מייצגות של פיפטות זכוכית. (A) להציג פיפטות עם התנגדות נמוכה יותר (6.5 MΩ), המשמשות בפרוטוקול זה, ו-(B) פיפטות עם התנגדות גבוהה יותר (10.4 MΩ) האופייניות לפרוטוקולי אלקטרופורציה.