$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.
1. מודל חבלה/דחיסה של קליפ מפרצת צוואר הרחם
- לפני הניתוח, חיטוי מכשירים ושמור אותם סטריליים במהלך כל ההליך הכירורגי על ידי הכנסתם לאמבט אלכוהול של 70%.
- להרדים חולדות Wistar (250-270 גרם) עם שילוב של חמצן (O2), תחמוצת החנקן (N2O) (1:1) ו-1.8-2.2% איזופלורן ולתמוך בנשימה ספונטנית באמצעות מסכת הרדמה בגז. לזירוז הרדמה, יש להתחיל עם איזופלורן 5% למשך דקה אחת ולהפחית לאחר מכן. לפני תחילת הניתוח, שלוט בעומק ההרדמה על ידי מתן גירוי כואב (למשל, בכפות). מרחו משחות שומניות בעיניים כדי למנוע יובש וכדי למנוע זיהומים לאחר מכן.
- הניחו את החולדות על כרית חימום (37 מעלות צלזיוס) וקבעו את הראש למסגרת סטריאוטקטית.
- לגלח את אזור הניתוח סביב עמוד השדרה הצווארי ולחטא עם פובידון-יוד ו-70% אלכוהול.
- בצע חתך בקו האמצע מעל עמוד השדרה מחוליה צווארית הרחם (C2) ומגיע לתהליך הבולט של גוף החוליה החזי 2 (T2).
- חותכים את השכבה החיצונית של שרירי החוליות ישירות על קו האמצע (כדי למנוע דימום) בכיוון גולגולתי-זנב ומנתחים עוד יותר את שכבות השרירים העמוקות יותר בצורה בוטה עד שתגיעו ל-processus spinosus ול-laminae. הכנס מחזירים.
- כוון את ה-processus spinosus הבולט של גוף החוליה T2 כדי להתבונן ברמות היעד לכריתת למינקטומיה. לאחר זיהוי והכנה מיקרו-כירורגית של הלמינאות שנבחרו, חתכו את ה-ligamenti flavae כדי לשחרר את הלמינה ואת ה-processus spinosus. לבסוף, חתכו את הלמינה בעזרת קוצץ עצם לרוחב חוט השדרה והסירו אותם בעדינות, הימנעו מכל דחיסה של חוט השדרה עצמו.
הערה: הרמות הנפוצות ביותר הן C5/6, C6/7 או C7/T1. שיעור התמותה סביב הניתוח עולה ככל שרמת הפגיעה יותר רוסטרלית. דימום מהסינוס הוורידי הפרה-חולייתי הוא שכיח וניתן לטפל בו על ידי דחיסה זהירה עם ספוג. - לפני הכנסת הקליפס כדי לגרום לטראומה של חבל הטבור, זהה שורשי עצב מתעוררים כדי למנוע מהם גזירה (במיוחד ברמות C5/6).
- על מנת להבטיח השראת קליפ חלקה, שחרר את הדורה הגחונית מהצד הגבי של גופי החוליות בעזרת וו והכין מסדרון לקליפ.
- לבסוף, הכנס את הקליפ הפתוח ותן לו להיסגר בנקישה (סגירה מהירה) כדי להשיג פציעת חבלה. כוח סגירת הקליפ ומשך סגירת הקליפ קובעים את עוצמת הטראומה ואת מידת הדחיסה. בשימוש נפוץ הם כוחות קליפס של בין 15-35 גרם ומשך גזירה של, למשל, דקה אחת (איור 1).
- לאחר הסרת הקליפ, התאימו את השרירים בשתי שכבות וסגרו את הפצע.
- הפסיקו את ההרדמה ותנו לבעל החיים להתעורר תחת השגחתכם המתמשכת עד שהוא יחזור להכרה מספקת לשכיבה על עצם החזה. לבסוף, הכניסו את החולדה לכלוב יחיד ופעלו לפי הנחיות הטיפול לאחר הניתוח.
- מכיוון שבעלי חיים נאבקים בחומרת פציעה מסוג זה, עליך לשים לב במיוחד לטיפולים לאחר הניתוח:
- לתת משככי כאבים (בופרנורפין ומלוקסיקם למשך 3 ימים ו-5 ימים, בהתאמה, ובהתאם לתסמינים הקליניים).
- יש לתת תמיסת מלח נוספת תת עורית למשך 3 ימים (פעמיים ביום, 5-10 מיליליטר (מ"ל)).
- יש לספק אנטיביוטיקה במי השתייה יומיים לפני ועד 7 ימים לאחר הניתוח (למשל, מוקסיפלוקסצין)
- יש ללחוץ על שלפוחית השתן 2-3 פעמים ביום עד להחלמה מתמדת של תפקוד שלפוחית השתן.
- התבונן בליקויים נוירולוגיים ובמצב הפיזיולוגי של בעלי החיים המנותחים לפחות פעם ביום.
2. הזרקת SAPs ו-NPCs (14 יום לאחר הפציעה)
- לגרום להרדמה כמתואר ב-1.1 עד 1.3, לקבע את ראש החולדה במסגרת סטריאוטקטית, להסיר את התפרים או את קליפס הפצע, ולחטא את הפצע ואת אזור הניתוח עם פובידון-יוד ו-70% אלכוהול.
- נתחו בזהירות את שרירי הפרא-חוליות, הכניסו מחזירים, הסירו רקמת צלקת מיקרוסקופית מהדורה וחשפו מחדש את אתר הנגע.
- הכן SAPs בריכוז של 1% (w/v) לביצוע ג'ל מטריצה חוץ-תאית. ל-QL6 SAPs יש pH תואם פיזיולוגית ואין צורך לחצץ אותם לפני ההזרקה. להדמיה של SAPs בחוט השדרה, השתמש בנגזרת פלואורסצנטית של QL6 (QL6-fluorescein isothiocyanate [FITC]).
- הזרקת SAPs (5 מיקרוליטר (μl) למרכז הנגע, המופצים ב-2 מנות, כל אחת 2.5 מיקרוליטר דו-צדדית מקו האמצע. השתמש במזרק המילטון המחובר למסגרת הסטריאוטקטית עם נימי מיקרו זכוכית (קוטר חיצוני של 100 מיקרומטר (מיקרומטר) [OD]). פתחו את הדורה בזהירות עם קצה מחט חדה, והכניסו את נימי הזכוכית באופן סטריאוטקטי 2 מילימטרים (מ"מ) לחוט השדרה הפגוע.
- לאחר הזרקת 1/3 מהנפח, הסר את המחט לעומק של 1.5 מ"מ, ולאחר 1/3 עד 1 מ"מ נוספים. לאחר הזרקת כל הנפח, ולפני הסרת המזרק, המתן 5 דקות לייצוב היווצרות הג'ל.
- כדי ליצור NPCs, השתמש בעכברי חלבון פלואורסצנטי אדום (DsRed) בוגרים (או עכברים חיוביים לחלבון פלואורסצנטי צהוב [YFP], ירוק) ובודד וטפח אותם מהאזור הפרה-חדרי.
- העריכו את הכדאיות של NPCs על ידי צביעת Trypan Blue, המעידה על נוכחות של ~90% תאים חיים בתרחיף התא. לדלל את התאים במצע גידול (50 x 103 תאים חיים/מיקרוליטר) ולאחר מכן להשתמש בהם להשתלת תאים.
- בצע ארבע זריקות תוך שדרתיות של 2 מיקרוליטר (8 מיקרוליטר נפח כולל, המכיל 4 x 105 NPCs) דו-צדדית ב-2 מ"מ רוסטרל וזנב של אתר הפגיעה. לאחר פתיחת הדורה, הכנס את נימי הזכוכית המיקרו של המילטון 1.5 מ"מ מתחת לפני השטח הגביים של חוט השדרה והזריק 2 מיקרוליטר של מתלה התאים. בחר קצב הזרקה של כ-0.5 מיקרוליטר לדקה (דקות).
- בסוף כל הזרקה ולפני הוצאת הנימים מהחוט, המתינו לפחות דקה אחת, ואפשרו למתיחת הרקמה כדי להתאים לנפח התא החדש. (איור 2)
