מניפולציה אופטוגנטית של מעגלים עצביים למעבר משינה לערות בעכברים

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. ניתוחים לבעלי חיים, הזרקת וירוסים, אלקטרודה ל-EEG/EMG והשתלת סיבים אופטיים

זהירות: יש לבחור טכניקות הגנה וטיפול מתאימות על סמך רמת הבטיחות הביולוגית של הנגיף שיש להשתמש בו. יש להשתמש בנגיף הקשור לאדנו (AAV) בחדר מבודד בדירוג P1A להזרקה, ויש לעקר את הצינור הנושא AAV עם חיטוי לאחר שכל הנפח נגמר. אתר הניתוח וכל החומר המושתל צריכים להיות נקיים וסטריליים במהלך השימוש.

הערה: ראה איור 1.

1. חיטוי הציוד הכירורגי עם החיטוי.

2. להרדים עכברים עם איזופלורן באמצעות מכשיר אידוי הרדמה. התבונן עד שהעכבר הגיע לעומק ההרדמה הרצוי, שנקבע על ידי אובדן תגובה לצביטה של הזנב במלקחיים. מרחו משחה עיניים על העיניים כדי למנוע את התייבשותן.

3. לחטא את השדה הניתוחי בתמיסת יוד או 70% אתנול (EtOH, 3x) ולייבש מספיק. אפשר לנגיף להפשיר על קרח בזמן ביצוע הניתוח. כסו את אזור הניתוח בנייר ספסל מעבדה סופג.

4. תקן את ראש העכבר במנגנון הסטריאוטקטי עם מוטות אוזניים וצביטה באף. לאחר אישור שהראש מוחזק ביציבות, בצע חתך באמצע הקרקפת כדי להבטיח שמיקומם של הברגמה והלמבדה ממוקמים באותה רמה על קו אופקי.

5. כדי למנוע פער מיקום, התאם כראוי את רמות צביטת האף ומוטות האוזניים למעלה ולמטה. הברגמה והלמבדה מתייחסים להצטלבות בין ה-sutura saggitalis ו-sutura coronalis או sutura lambdoidal, בהתאמה (איור 2).

6. השתמש במלחציים של סראפין כדי להחזיק את העור כדי לשמור על גישה לגולגולת. לאחר חשיפת הגולגולת, יש לחטא את פני הגולגולת ביוד או 5% H₂O₂, כדי לאפשר הדמיה ברורה יותר של תפרי הגולגולת כולל הברגמה והלמבדה.

7. הכן הזרקת וקטור AAV:

1. שטפו את החלק הפנימי של מזרק של 10 מ"ל (ראה טבלת חומרים) ברצף עם 70% EtOH, 100% EtOH ומים מעוקרים, 5 פעמים כל אחד. אבטח את המזרק במהדק של זרוע משאבת מיקרו-הזרקה וודא שכל התמיסה במזרק משוחררת.

2. שאפו בזהירות 2 מיקרוליטר שמן מינרלי ללא בועות אוויר, ולאחר מכן שאפו את הנפח המיועד של תמיסת הנגיף. לאחר השאיפה, תפעל את כפתור הבוכנה ואשר שתמיסת הנגיף מגיחה בקצה המחט.

הערה: נפח ההזרקה של תמיסת הנגיף נקבע בניסויי פיילוט תוך שימוש באותו זן עכבר ובאותו מוצר וירוס. יש להעריך מראש את הקשר בין נפח תמיסת הנגיף להיקף אזור ההדבקה.

8. הזרקת וקטור AAV:

1. כוונן את קצה מחט המיקרו-הזרקה על הברגמה ורשום את הקואורדינטות כנקודה המקורית. העבר את הקצה לאתר ההזרקה המיועד (עבור ה- BNST: אנטרופוסטריור + 0.2 מ"מ, בינוני ± 1.0 מ"מ, גב וונטרלי - 4.2 מ"מ) והנח את קצה המחט במצב. שים סימן על הגולגולת וקדח חורים בקוטר של כ-2 מ"מ באמצעות מקדחה דנטלית עם חותך קרביד 0.7 מ"מ. היזהר לא לפגוע בדורה או ברקמת המוח.

2. לאחר הוצאת דם מסביב לחורים בעזרת צמר גפן, הזיזו לאט את המחט למצב ה-BNST. הזריק לאט את הכמות המיועדת של תמיסת הנגיף (0.07 מיקרוליטר לדקה) עם מיקרו-מזרק מכני. לאחר השלמת ההזרקה, השאירו את המחט למשך 5 דקות כדי לאפשר לתמיסה לחדור מספיק לרקמת ה-BNST. הסר בזהירות את המחט.

3. עבור הזרקות דו-צדדיות, חזור על שלבים 1.8.1-1.8.2 בצד השני. לאורך כל ההליך, יש למרוח מי מלח סטריליים כדי לשמור על לחות הגולגולת.

הערה: השתמשנו בשתלי אלקטרואנצפלוגרפיה מותאמים אישית (EEG)/אלקטרומיוגרפיה (EMG) (רוחב: 5 מ"מ, עומק: 7 מ"מ, גובה: 1 מ"מ) עם ארבע אלקטרודות EEG (4 מ"מ), שתי אלקטרודות EMG (2 מ"מ; חתכו את האלקטרודה 4 מ"מ ל-2 מ"מ עם ציפורניים) ו-6 אלקטרודות (4.5 מ"מ) (איור 2A).

9. הלחמו שני חוטי נירוסטה (ראה טבלת חומרים) שמהם מופשט 1 מ"מ מהבידוד משני הקצוות לאלקטרודות EMG. התאם את מרכז האלקטרודות לברגמה, סמן את המיקום של כל אלקטרודת EEG (קדמית אחורית ± 1.5 מ"מ, בינוני ± 1.0 מ"מ), וקבע את מיקום השתל (איור 2B).

10. השתלת סיבים אופטיים:

1. חבר טבעת סיבים אופטיים למניפולטור וסובב את זרוע המניפולטור כך שתהיה לה זווית של ±30 מעלות כנגד קו אופקי (תהליך זה נחוץ רק כדי למנוע הפרעות בין אלקטרודות לסיבים אופטיים, כמו במקרה של גירוי BNST). הניחו את קצה הסיבים על הברגמה ורשמו את הקואורדינטות.

2. הזז את הקצה לשורת ההכנסה היעד וסמן את המיקום על הגולגולת. כמו כן, שים סימנים נוספים ליד אתר ההחדרה עבור ברגי העיגון. קדחו את הגולגולת בכל אתר בעזרת מקדחה דנטלית כדי להכניס את הסיב האופטי ולתקן את הבורג. תקן את הבורג בגולגולת. היזהר לא לשבור את הדורה או לפגוע ברקמה כלשהי עם הבורג.

3. הכנס את הסיב האופטי בעדינות עד שתגיע מעל ה-BNST עם מניפולטור. החוט צריך לנוח על הגולגולת שנותרה (איור 1B).

4. מרחו צמנט דנטלי הניתן לריפוי (ראה טבלת חומרים) כדי לכסות את הסיב והבורג. יש לציין את זמן התגובה להתמצקות הדבק במדריך היצרן (החומר שלנו זקוק לחשיפה לאור למשך 10 שניות לפחות עם מחוללי צילום באורך גל ספציפי. מיותר לייבש את הדבק לאחר מכן).

5. בשלב זה, ודא שאף חומר (ברגים או דבק) לא תופס את שטח ההרכבה של האלקטרודות. בנוסף, הימנע מהפרעה כלשהי במלט עבור הטבעת המתחברת לסיב האופטי ולכבל. חזור על שלבים 1.10.1-1.10.4 בצד הנגדי לגירוי דו-צדדי.

11. קדחו חורים לאלקטרודות EEG/EMG. הכנס את קצות האלקטרודות לחורים. החזק את השתל והחל דבק ציאנואקרילט על החלל שבין הגולגולת לאלקטרודות. הכנס שוב בתשומת לב לא להפריע לחומרים כלשהם.

12. מכסים את היקף האלקטרודות והסיבים האופטיים בדבק ציאנואקרילט, ולאחר מכן מריחת מאיץ ציאנואקרילט על הדבק. שלב זה נמנע מגרימת הפרעה כלשהי באזור החיבור של כבל פרול-אופטי וחוט אלקטרודה לעופרת (איור 1C).

הערה: דבק ציאנואקרילט והמאיץ שלו מזיקים לעין העכבר. שימו לב לא לגרום לשפיכה של חומרים כימיים אלה. כמו כן, היזהר לא לגעת חזק באלקטרודות ובסיבים על מנת למנוע סטייה בלתי צפויה מיד לאחר התמצקות הדבק.

13. חשוף את שרירי צוואר העכבר והכנס את החוטים לאלקטרודת EMG מתחת לשריר. התאם את אורך אלקטרודת ה- EMG כך שהיא ממוקמת ממש מתחת לשרירי העורף. מספיק חיבור קל בין קצה האלקטרודה לפאשיה של השריר כדי לתפוס את אות ה- EMG.

14. מרחו דבק ציאנואקרילט כדי למלא את השתלים ולמצק את הדבק בנוזל תאוצה. לאחר מכן, הניחו את העכבר על כרית חימום להתאוששות עד להופעת רפלקס היציבה. התאם את טמפרטורת כרית החימום לטמפרטורת גוף המנוחה של בעלי החיים (36.0 מעלות צלזיוס ב-ZT 0-12 במקרה של עכברי C57BL6; אל תעלה על 38.0 מעלות צלזיוס).

הערה: אין צורך באנטיביוטיקה לניתוח סטרילי. עקוב אחר הנחיות המוסד המקומי שלך לשיכוך כאבים לאחר הניתוח. שמור את העכברים בכלוב ביתי לתקופת החלמה של 7 ימים לפחות.

2. ניטור EEG/EMG עם עירור פוטו של נוירונים ממוקדים במצבי שינה ספציפיים

זהירות: פרוטוקול זה כולל שימוש בציוד לייזר מסוג 3B או התקני LED. הנסיינים צריכים להיות מודעים למידע בטיחותי. נדרשים משקפי מגן.

1. לפני חיבור כבל הלייזר לסיב האופטי, כוונן את עוצמת הלייזר בעזרת סקלר. קשרו את קצה כבל הלייזר לסיב אופטי שאינו בשימוש בעזרת טבעת ואשרו שאין מקום בצומת בין הסיב לכבל.

2. הפעל את המתג הראשי של הלייזר והמתן 20 דקות עד שהוא יתחמם.

3. פלוט את הלייזר לבודק העוצמה והתאם את עוצמת הלייזר ל-10 mW/mm². שנה את מצב הלייזר ללוגיקת טרנזיסטור ואשר שפולסי אור נפלטים מהסיב הנשלט על ידי ווסת התבנית, המוגדר ל-10 אלפיות השנייה למשך זמן, 40 אלפיות השנייה למנוחה, 20 פעמים למחזור ו-20 פעמים חוזרות על עצמן (כלומר, 20 הרץ של פולסי אור של 10 אלפיות השנייה למשך 20 שניות).

4. לאחר תקופת ההתאוששות, העבירו את העכברים לתא הניסוי לרישום EEG/EMG. עכברי הבית הוחזקו בטמפרטורה קבועה של 23 מעלות צלזיוס עם מחזור אור/חושך של 12 שעות עם מזון ומים זמינים אד-ליביטום.

5. חבר את האלקטרודה המושתלת ומתאם הכבלים הקשורים לטבעת החלקה כדי למנוע הסתבכות. מומלץ לכסות את הצומת בחומר אטום לאור כגון נייר אלומיניום למניעת דליפת לייזר. אם נדרש ניסוי דו-צדדי, השתמש בטבעת החלקה עם חיבור מסועף לכבלים.

6. בפרוטוקול זה, אנו מעריכים חביון לערות משנת תנועת עיניים לא מהירה (NREM) או שנת תנועת עיניים מהירה (REM), ולכן יש להגביל את זמן ההקלטה בזמן צייטגבר אופטימלי (ZT0 מוגדר כזמן שבו האור דולק). פרוטוקול זה נערך בין ZT4 - ZT10. תנו לעכברים להישאר בחופשיות בתא הניסוי לפחות שעה אחת כהתאקלמות.

7. במהלך תקופת הניסוי, עקוב אחר אותות EEG ו-EMG באותו מוניטור והעריך את מצב העכבר כערות, שנת NREM או שנת REM. השתמש בבקרת הרווח עבור כל גל כדי להקל על ההבחנה בין כל מצב.

8. למדידת שנת NREM עד חביון ערות, התבונן בשנת NREM יציבה למשך 40 שניות או שנת REM יציבה למשך 30 שניות, ולאחר מכן הפעל את המתג של מחולל הדפוסים לגירוי פוטו (פרוטוקול זה מייצר 20 הרץ של פולסי אור של 10 אלפיות השנייה למשך 20 שניות). אשר את פליטת הלייזר לסיבים האופטיים המושתלים.

9. הקלט אותות EEG / EMG עד שמצב השינה משתנה לערות. אם יש צורך בשני ניסויים ניסיוניים או יותר, הגבילו את המניפולציה האופטוגנטית לפעם ביום מכיוון שגירוי פוטו-סטימולציה הוא התערבות מלאכותית שעלולה להשפיע על ארכיטקטורת השינה/ערות.

10. לאחר הניסוי, יש להרדים עמוק ולחלחל עם מי מלח סטריליים ופרפורמלדהיד (PFA) לדגימת כל המוח לניתוח אימונוהיסטוכימי.

איור 1: הליך להזרקת AAV, השתלת סיבים אופטיים ושתלי EEG/EMG. (A) הליך ניסיוני של הזרקת וירוסים. גן ChR2 או EYFP (לבקרה) התמזג עם EYFP המשולב בווקטור AAV שהשעתוק שלו מופעל על ידי Cre recombinase הוזרק דו-צדדית ל-BNST. (B) סיבים אופטיים הוכנסו לכיוון ה-BNST בזווית של 30 מעלות לאופק כדי למנוע התנגשות עם האלקטרודה. שני ברגים הוכנסו סביבו. (C) מכשיר הקלטת EEG/EMG הושתל לאחר מיקום בטוח של הסיבים האופטיים. (ד) בסיום הניתוח, יש לכסות את כל אזור הניתוח בדבק ציאנואקרילט ולקבע אותו היטב. הקפד לא למרוח שום חומר על האזור המחבר בין האלקטרודה והטבעות.

איור 2: אתרי הכנסת אלקטרודות ופיני אלקטרודות EEG/EMG מותאמים אישית. (א) למעלה: מתוך 6 פיני אלקטרודה, שני הפינים החיצוניים נחתכים ל-2 מ"מ. למטה: אלקטרודות EEG/EMG. (B) האלקטרודות האלה וחוטי ההולכה של EMG מולחמים. יש לבודד את אזור החיבור עם כל בידוד, כמו דבק ציאנואקרילט. אתרי החדרת האלקטרודות הם יחסית לברגמה (אנטרופוסטריור ± 1.5 מ"מ, מדיולטרלי ± 1.0 מ"מ). חוטי EMG מוכנסים מתחת לשריר הצוואר עם הסרת בידוד המגן על החוט באתר ההחדרה (1 מ"מ).