מניפולציה אופטוגנטית של מעגלים עצביים למעבר משינה לערות בעכברים

תקציר

מקור: Kodani, S., et.al. מניפולציה אופטוגנטית של מעגלים עצביים במהלך ניטור מצבי שינה/ערות בעכברים. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את המניפולציה האופטוגנטית של מעגלים עצביים המעורבים במעבר משינה לערות בעכברים. ההליך כולל השתלה כירורגית של סיב אופטי ואלקטרודות במוח ובשרירים כדי לאפשר גירוי אור ורישום אלקטרופיזיולוגי. על ידי אספקת אור להפעלת תעלות קטיון רגישות לאור בגרעין המיטה של הסטריה טרמינליס (BNST), הפעילות העצבית מווסתת, ומאפשרת לחוקרים לנתח אותות מוחיים ושרירים הקשורים לאינדוקציה של ערות.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. ניתוחים לבעלי חיים, הזרקת וירוסים, אלקטרודה ל-EEG/EMG והשתלת סיבים אופטיים

זהירות: יש לבחור טכניקות הגנה וטיפול מתאימות על סמך רמת הבטיחות הביולוגית של הנגיף שיש להשתמש בו. יש להשתמש בנגיף הקשור לאדנו (AAV) בחדר מבודד בדירוג P1A להזרקה, ויש לעקר את הצינור הנושא AAV עם חיטוי לאחר שכל הנפח נגמר. אתר הניתוח וכל החומר המושתל צריכים להיות נקיים וסטריליים במהלך השימוש.

הערה: ראה איור 1.

1. חיטוי הציוד הכירורגי עם החיטוי.

2. להרדים עכברים עם איזופלורן באמצעות מכשיר אידוי הרדמה. התבונן עד שהעכבר הגיע לעומק ההרדמה הרצוי, שנקבע על ידי אובדן תגובה לצביטה של הזנב במלקחיים. מרחו משחה עיניים על העיניים כדי למנוע את התייבשותן.

3. לחטא את השדה הניתוחי בתמיסת יוד או 70% אתנול (EtOH, 3x) ולייבש מספיק. אפשר לנגיף להפשיר על קרח בזמן ביצוע הניתוח. כסו את אזור הניתוח בנייר ספסל מעבדה סופג.

4. תקן את ראש העכבר במנגנון הסטריאוטקטי עם מוטות אוזניים וצביטה באף. לאחר אישור שהראש מוחזק ביציבות, בצע חתך באמצע הקרקפת כדי להבטיח שמיקומם של הברגמה והלמבדה ממוקמים באותה רמה על קו אופקי.

5. כדי למנוע פער מיקום, התאם כראוי את רמות צביטת האף ומוטות האוזניים למעלה ולמטה. הברגמה והלמבדה מתייחסים להצטלבות בין ה-sutura saggitalis ו-sutura coronalis או sutura lambdoidal, בהתאמה (איור 2).

6. השתמש במלחציים של סראפין כדי להחזיק את העור כדי לשמור על גישה לגולגולת. לאחר חשיפת הגולגולת, יש לחטא את פני הגולגולת ביוד או 5% H₂O₂, כדי לאפשר הדמיה ברורה יותר של תפרי הגולגולת כולל הברגמה והלמבדה.

7. הכן הזרקת וקטור AAV:

1. שטפו את החלק הפנימי של מזרק של 10 מ"ל (ראה טבלת חומרים) ברצף עם 70% EtOH, 100% EtOH ומים מעוקרים, 5 פעמים כל אחד. אבטח את המזרק במהדק של זרוע משאבת מיקרו-הזרקה וודא שכל התמיסה במזרק משוחררת.

2. שאפו בזהירות 2 מיקרוליטר שמן מינרלי ללא בועות אוויר, ולאחר מכן שאפו את הנפח המיועד של תמיסת הנגיף. לאחר השאיפה, תפעל את כפתור הבוכנה ואשר שתמיסת הנגיף מגיחה בקצה המחט.

הערה: נפח ההזרקה של תמיסת הנגיף נקבע בניסויי פיילוט תוך שימוש באותו זן עכבר ובאותו מוצר וירוס. יש להעריך מראש את הקשר בין נפח תמיסת הנגיף להיקף אזור ההדבקה.

8. הזרקת וקטור AAV:

1. כוונן את קצה מחט המיקרו-הזרקה על הברגמה ורשום את הקואורדינטות כנקודה המקורית. העבר את הקצה לאתר ההזרקה המיועד (עבור ה- BNST: אנטרופוסטריור + 0.2 מ"מ, בינוני ± 1.0 מ"מ, גב וונטרלי - 4.2 מ"מ) והנח את קצה המחט במצב. שים סימן על הגולגולת וקדח חורים בקוטר של כ-2 מ"מ באמצעות מקדחה דנטלית עם חותך קרביד 0.7 מ"מ. היזהר לא לפגוע בדורה או ברקמת המוח.

2. לאחר הוצאת דם מסביב לחורים בעזרת צמר גפן, הזיזו לאט את המחט למצב ה-BNST. הזריק לאט את הכמות המיועדת של תמיסת הנגיף (0.07 מיקרוליטר לדקה) עם מיקרו-מזרק מכני. לאחר השלמת ההזרקה, השאירו את המחט למשך 5 דקות כדי לאפשר לתמיסה לחדור מספיק לרקמת ה-BNST. הסר בזהירות את המחט.

3. עבור הזרקות דו-צדדיות, חזור על שלבים 1.8.1-1.8.2 בצד השני. לאורך כל ההליך, יש למרוח מי מלח סטריליים כדי לשמור על לחות הגולגולת.

הערה: השתמשנו בשתלי אלקטרואנצפלוגרפיה מותאמים אישית (EEG)/אלקטרומיוגרפיה (EMG) (רוחב: 5 מ"מ, עומק: 7 מ"מ, גובה: 1 מ"מ) עם ארבע אלקטרודות EEG (4 מ"מ), שתי אלקטרודות EMG (2 מ"מ; חתכו את האלקטרודה 4 מ"מ ל-2 מ"מ עם ציפורניים) ו-6 אלקטרודות (4.5 מ"מ) (איור 2A).

9. הלחמו שני חוטי נירוסטה (ראה טבלת חומרים) שמהם מופשט 1 מ"מ מהבידוד משני הקצוות לאלקטרודות EMG. התאם את מרכז האלקטרודות לברגמה, סמן את המיקום של כל אלקטרודת EEG (קדמית אחורית ± 1.5 מ"מ, בינוני ± 1.0 מ"מ), וקבע את מיקום השתל (איור 2B).

10. השתלת סיבים אופטיים:

1. חבר טבעת סיבים אופטיים למניפולטור וסובב את זרוע המניפולטור כך שתהיה לה זווית של ±30 מעלות כנגד קו אופקי (תהליך זה נחוץ רק כדי למנוע הפרעות בין אלקטרודות לסיבים אופטיים, כמו במקרה של גירוי BNST). הניחו את קצה הסיבים על הברגמה ורשמו את הקואורדינטות.

2. הזז את הקצה לשורת ההכנסה היעד וסמן את המיקום על הגולגולת. כמו כן, שים סימנים נוספים ליד אתר ההחדרה עבור ברגי העיגון. קדחו את הגולגולת בכל אתר בעזרת מקדחה דנטלית כדי להכניס את הסיב האופטי ולתקן את הבורג. תקן את הבורג בגולגולת. היזהר לא לשבור את הדורה או לפגוע ברקמה כלשהי עם הבורג.

3. הכנס את הסיב האופטי בעדינות עד שתגיע מעל ה-BNST עם מניפולטור. החוט צריך לנוח על הגולגולת שנותרה (איור 1B).

4. מרחו צמנט דנטלי הניתן לריפוי (ראה טבלת חומרים) כדי לכסות את הסיב והבורג. יש לציין את זמן התגובה להתמצקות הדבק במדריך היצרן (החומר שלנו זקוק לחשיפה לאור למשך 10 שניות לפחות עם מחוללי צילום באורך גל ספציפי. מיותר לייבש את הדבק לאחר מכן).

5. בשלב זה, ודא שאף חומר (ברגים או דבק) לא תופס את שטח ההרכבה של האלקטרודות. בנוסף, הימנע מהפרעה כלשהי במלט עבור הטבעת המתחברת לסיב האופטי ולכבל. חזור על שלבים 1.10.1-1.10.4 בצד הנגדי לגירוי דו-צדדי.

11. קדחו חורים לאלקטרודות EEG/EMG. הכנס את קצות האלקטרודות לחורים. החזק את השתל והחל דבק ציאנואקרילט על החלל שבין הגולגולת לאלקטרודות. הכנס שוב בתשומת לב לא להפריע לחומרים כלשהם.

12. מכסים את היקף האלקטרודות והסיבים האופטיים בדבק ציאנואקרילט, ולאחר מכן מריחת מאיץ ציאנואקרילט על הדבק. שלב זה נמנע מגרימת הפרעה כלשהי באזור החיבור של כבל פרול-אופטי וחוט אלקטרודה לעופרת (איור 1C).

הערה: דבק ציאנואקרילט והמאיץ שלו מזיקים לעין העכבר. שימו לב לא לגרום לשפיכה של חומרים כימיים אלה. כמו כן, היזהר לא לגעת חזק באלקטרודות ובסיבים על מנת למנוע סטייה בלתי צפויה מיד לאחר התמצקות הדבק.

13. חשוף את שרירי צוואר העכבר והכנס את החוטים לאלקטרודת EMG מתחת לשריר. התאם את אורך אלקטרודת ה- EMG כך שהיא ממוקמת ממש מתחת לשרירי העורף. מספיק חיבור קל בין קצה האלקטרודה לפאשיה של השריר כדי לתפוס את אות ה- EMG.

14. מרחו דבק ציאנואקרילט כדי למלא את השתלים ולמצק את הדבק בנוזל תאוצה. לאחר מכן, הניחו את העכבר על כרית חימום להתאוששות עד להופעת רפלקס היציבה. התאם את טמפרטורת כרית החימום לטמפרטורת גוף המנוחה של בעלי החיים (36.0 מעלות צלזיוס ב-ZT 0-12 במקרה של עכברי C57BL6; אל תעלה על 38.0 מעלות צלזיוס).

הערה: אין צורך באנטיביוטיקה לניתוח סטרילי. עקוב אחר הנחיות המוסד המקומי שלך לשיכוך כאבים לאחר הניתוח. שמור את העכברים בכלוב ביתי לתקופת החלמה של 7 ימים לפחות.

2. ניטור EEG/EMG עם עירור פוטו של נוירונים ממוקדים במצבי שינה ספציפיים

זהירות: פרוטוקול זה כולל שימוש בציוד לייזר מסוג 3B או התקני LED. הנסיינים צריכים להיות מודעים למידע בטיחותי. נדרשים משקפי מגן.

1. לפני חיבור כבל הלייזר לסיב האופטי, כוונן את עוצמת הלייזר בעזרת סקלר. קשרו את קצה כבל הלייזר לסיב אופטי שאינו בשימוש בעזרת טבעת ואשרו שאין מקום בצומת בין הסיב לכבל.

2. הפעל את המתג הראשי של הלייזר והמתן 20 דקות עד שהוא יתחמם.

3. פלוט את הלייזר לבודק העוצמה והתאם את עוצמת הלייזר ל-10 mW/mm². שנה את מצב הלייזר ללוגיקת טרנזיסטור ואשר שפולסי אור נפלטים מהסיב הנשלט על ידי ווסת התבנית, המוגדר ל-10 אלפיות השנייה למשך זמן, 40 אלפיות השנייה למנוחה, 20 פעמים למחזור ו-20 פעמים חוזרות על עצמן (כלומר, 20 הרץ של פולסי אור של 10 אלפיות השנייה למשך 20 שניות).

4. לאחר תקופת ההתאוששות, העבירו את העכברים לתא הניסוי לרישום EEG/EMG. עכברי הבית הוחזקו בטמפרטורה קבועה של 23 מעלות צלזיוס עם מחזור אור/חושך של 12 שעות עם מזון ומים זמינים אד-ליביטום.

5. חבר את האלקטרודה המושתלת ומתאם הכבלים הקשורים לטבעת החלקה כדי למנוע הסתבכות. מומלץ לכסות את הצומת בחומר אטום לאור כגון נייר אלומיניום למניעת דליפת לייזר. אם נדרש ניסוי דו-צדדי, השתמש בטבעת החלקה עם חיבור מסועף לכבלים.

6. בפרוטוקול זה, אנו מעריכים חביון לערות משנת תנועת עיניים לא מהירה (NREM) או שנת תנועת עיניים מהירה (REM), ולכן יש להגביל את זמן ההקלטה בזמן צייטגבר אופטימלי (ZT0 מוגדר כזמן שבו האור דולק). פרוטוקול זה נערך בין ZT4 - ZT10. תנו לעכברים להישאר בחופשיות בתא הניסוי לפחות שעה אחת כהתאקלמות.

7. במהלך תקופת הניסוי, עקוב אחר אותות EEG ו-EMG באותו מוניטור והעריך את מצב העכבר כערות, שנת NREM או שנת REM. השתמש בבקרת הרווח עבור כל גל כדי להקל על ההבחנה בין כל מצב.

8. למדידת שנת NREM עד חביון ערות, התבונן בשנת NREM יציבה למשך 40 שניות או שנת REM יציבה למשך 30 שניות, ולאחר מכן הפעל את המתג של מחולל הדפוסים לגירוי פוטו (פרוטוקול זה מייצר 20 הרץ של פולסי אור של 10 אלפיות השנייה למשך 20 שניות). אשר את פליטת הלייזר לסיבים האופטיים המושתלים.

9. הקלט אותות EEG / EMG עד שמצב השינה משתנה לערות. אם יש צורך בשני ניסויים ניסיוניים או יותר, הגבילו את המניפולציה האופטוגנטית לפעם ביום מכיוון שגירוי פוטו-סטימולציה הוא התערבות מלאכותית שעלולה להשפיע על ארכיטקטורת השינה/ערות.

10. לאחר הניסוי, יש להרדים עמוק ולחלחל עם מי מלח סטריליים ופרפורמלדהיד (PFA) לדגימת כל המוח לניתוח אימונוהיסטוכימי.

תוצאות

איור 1: הליך להזרקת AAV, השתלת סיבים אופטיים ושתלי EEG/EMG. (A) הליך ניסיוני של הזרקת וירוסים. גן ChR2 או EYFP (לבקרה) התמזג עם EYFP המשולב בווקטור AAV שהשעתוק שלו מופעל על ידי Cre recombinase הוזרק דו-צדדית ל-BNST.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1x1 סיבים אופטיים סיבים סיבוביים מפרקים דוריים		FRJ 1x1 FC-FC	לאופטוגנטיקה
כותרת 6 פינים	תאגיד KEL	DSP02-006-431G
שקע 6 פינים	Hirose	21602X3GSE
ממיר A/D	Nippon koden	N/A	ממיר אנלוגי לדיגיטלי
AAV_{10} -EF1a-DIO-ChR2-EYFP			3.70×10^{13} (עותקים גנומיים/מ"ל)
AAV_{10} -EF1a-DIO-EYFP			5.82×10^{13} (עותקים גנומיים/מ"ל)
Ampicillin	Fuji film	014-23302
מגבר	Nippon koden	N / A	עבור הקלטת EEG / EMG
וופורייזר הרדמה	Muromachi	MK-AT-210D
מזרק אוטומטי	KD חותך
	Minitor	B1055	φ0.7 מ"מ. מתייחס כמקדחה דנטלית, בשימוש עם מיקרו-מנוע סיבובי במהירות גבוהה
הידבקות ציאנואקרילט (ארון אלפא A) ותאוצה	Konishi	#30533
אור ריפוי שיניים	3M	Elipar S10
דבק אפוקסי	Konishi	#04888	בידוד סביב ההלחמה של כבל 6 פינים וכבל מוגן
כבל תיקון סיבים אופטיים (הסתעפות)Doric		BFP(#)_50/125/900-0.22
עכברי GAD67-Cre	המסופקים על ידי ד"ר קנג'י סאקימורה		גן רקומבינאז Cre נדפק באלל Gad67
מזרק המילטון	המילטון	65461-01
ערכת מיקרו-מנוע סיבובי במהירות גבוהה	FOREDOM	K.1070	בשימוש עם חותך קרביד
שרוול חיבור	Thorlab	ADAF1	φ2.5 מ"מ קרמיקה
איזופלורן	פייזר	871119
לייזר	ראפ אופטואלקטרוני	N/A	אורך גל
בודק אינטנסיביות לייזר	קוהרנטי	1098293
ממריץ לייזר	מרכז מחקר ביולוגי	STO2	מתייחס כמחולל דופק בטקסט
סיבים אופטיים עם טבעת	Thorlab	FP200URT-CANNULA-SP-JP
pAAV2-rh10	מסופק על ידי PennVector Core
pAAV-EF1A-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA	Addgene	plasimid # 20296
pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA	מסופק על ידי ד"ר קארל דיסרות'
כבל תיקון	דוריק	D202-9089-0.4	אורך 0.4 מ', מוליך לייזר בין לייזר למפרק סיבובי
pHelper	Stratagene
צמנט דנטלי הניתן לריפוי	3M	56846
מהדק סראפין	Stoelting	52120-43P
כבל מוגן	mogami	W2780	הלחמה לשקע 6 פינים להקלטת EEG / EMG
תא הקלטת שינה	N/A	N/A	תוצרת קוסטום (21 ס"מ× 29 ס"מ × 19 ס"מ) עם מחזיק מיכל מים
תוכנת שלטי שינה	KISSEI COMTEC	N/A	לניתוח EEG / EMG
טבעת החלקה	מדעי המוח, inc	N / A	לניתוח EEG / EMG
בורג אל חלד	Yamazaki	N / A	φ1.0 x 2.0
חוט אל חלד	Cooner	AS633	קוטר 0.0130 אינץ '
מסגרת סטריאוטקסית עם קונסולה דיגיטלית	Koph	N / A	דגם 940
מחט מזרק	המילטון	7803-05
תוכנת מקליט חיוני	KISSEI COMTEC	לא ישים	להקלטת EEG/EMG

קרביד מדעי 780311 473 ננומטר חוט