גירוי עצב התועה באמצעות אלקטרודות שרוול עצב היקפי מושתלות באופן כרוני בחולדות

תקציר

מקור: Sanchez, C. A., et al. הכנת אלקטרודות לגירוי עצבי היקפי להשתלה כרונית בחולדות. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מדגים גירוי עצב תועה בחולדה ערה. חולדה עם אלקטרודת שרוול עצב היקפי כרונית מושתלת ומאומנת במשימת לחיצת מנוף מחוברת למחולל גירויים באמצעות מכסה ראש מושתל. עצב הנרתיק מגורה מיד לאחר כל לחיצת מנוף מוצלחת, וכתוצאה מכך מתרחבת המפה המוטורית.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. גירוי ייצור אלקטרודות שרוול

1. הכן את צינור השרוול.
   1. בעזרת סכין גילוח חותכים חתיכת צינור פולימרי באורך 2.5 מ"מ. הכנס קצות מלקחיים או מהדק נייר דרך הצינור והשתמש בלהב כדי ליצור חריץ לאורכו דרך דופן הצינור בצד אחד של השרוול.
   2. הסר את המלקחיים מהצינור והכנס מחט תפירה גדולה דרך קו האמצע של השרוול, בניצב לציר הארוך. הכנס את המחט דרך החריץ (למעלה) ולתוך מרכז הצינור שממול (למטה). הנח את המחט לתוך לוח הקצף כדי להצמיד את השרוול למקומו במהלך שלבי ההרכבה הנותרים.
2. הנח תפר כדי לאבטח את סגירת השרוול במהלך ההשתלה.
   1. הכנס את מחט התפירה הקטנה דרך דופן השרוול, בקו האמצע, כ-0.5 מ"מ מהחריץ העליון בצד אחד. הכנס את המחט מבפנים כלפי חוץ כדי למנוע נזק לצינור השרוול. הכנס תפר באורך 2 ס"מ של 6/0 דרך עין המחט ומשוך את המחט דרך דופן הצינור כדי להשחיל את התפר לתוך השרוול.
   2. השאר את החוט במקומו, הסר את המחט ונקב חור שני דרך דופן הצינור כ-0.5 מ"מ מתחת לחור הראשון, לאורך קו האמצע של השרוול. הכנס את התפר דרך עין המחט ומשוך את המחט דרך דופן הצינור כדי להשחיל שוב את התפר דרך השרוול.
   3. שני הקצוות של חוט התפר צריכים להיות כעת בצד החיצוני של השרוול. כוונן את התפר כך ש-~1.5 ס"מ יימשך מהחור העליון ו-~0.5 מ"מ מהחור התחתון.
   4. מרחו כמות קטנה של דבק ריפוי UV (אולטרה סגול) על הקצה הקצר של התפר המשתרע מהחור התחתון ומשכו את קצה התפר הארוך יותר עד שהזנב התחתון כמעט צמוד לדופן החיצונית של הצינור. השתמש בשרביט ה-UV כדי לרפא את הדבק ולהחזיק את התפר במקומו בחוזקה.
   5. חזור על שלבים 1.2.1 עד 1.2.3 בצד הנגדי של השרוול.
3. הנח את מובילי החוט Platinum:Iridium (Pt:Ir).
   1. השתמש במחט התפירה הקטנה כדי ליצור 4 חורים בדופן השרוול. יש למקם כל זוג חורים במרחק של כ-0.5-0.8 מ"מ מקו האמצע הניצב, עם חור במרחק של כ-0.5-0.8 מ"מ מהחריץ העליון משני צידי השרוול.
      זהירות: למיקום העקבי והמדויק ביותר של המוליכים, הכנס את המחט מבפנים לחוץ כדי ליצור את כל החורים, שימוש במיקום התפר כמדריך.
   2. הכנס שוב את מחט התפירה, הפעם עבד מבחוץ לפנים דרך חור עופרת 1. הכנס כ-0.5 ס"מ מאורך 7.5 ס"מ של חוט Pt:Ir דרך עין המחט ומשוך את המחט דרך הצינור כדי להשחיל את כבל החוט דרך דופן השרוול. כוונן את החוט כך ש-~4.5 ס"מ משתרע על הצד החיצוני של השרוול (איור 1A).
   3. הכנס שוב את המחט דרך חור העופרת 1, שוב עובד מבחוץ לפנים, ובנוסף הכנס את המחט דרך חור העופרת 2 ישירות מול חור העופרת 1. הכנס ~0.5 ס"מ מהקצה הקצר יותר (הפנימי) של חוט ה-Pt:Ir דרך עין המחט ומשוך את המחט דרך הצינור כדי להשחיל את כבל החוט דרך דפנות השרוול.
      הערה: שני הקצוות של חוט ה-Pt:Ir צריכים להיות כעת בצד החיצוני של השרוול, ונוצרת לולאת תיל סביב קצה החריץ ודרך חור עופרת 1 (איור 1B).
   4. חזור על שלבים 1.3.1 עד 1.3.3 כדי למקם חוט Pt:Ir דרך חורי עופרת 3 ו-4.
   5. בעזרת מצית בוטאן, הסר בזהירות את הבידוד מאורך של 5-6 מ"מ בקצה חוטי Pt:Ir המשתרעים מחור עופרת 2 וחור עופרת 4.
      זהירות: בודד את קצות המוליכים משאר מכלול השרוול בזהירות כדי למנוע נזק לשרוול. השתמש בכלים כדי להחזיק את החוטים כדי למנוע פציעה.
   6. יישר את החוט החשוף בתוך השרוול כדי למקם את המוליכים במיקומם הסופי. לשם כך, משוך בעדינות את קצה חוט ה-Pt:Ir המשתרע מחור 1 עד שהחלק הלא מבודד של החוט ישתלב עם חור 1. חזור על הפעולה עם הכבל השני כדי ליישר את הקצה הלא מבודד של החוט המושחל דרך חורי עופרת 3 ו-4.
   7. מרחו כמות קטנה של דבק לריפוי UV על לולאות החוט בצד החיצוני של השרוול בחורי עופרת 1 ו-3. השתמש בשרביט ה-UV כדי לרפא את הדבק ולאבטח את המוליכים במקומם.
   8. השתמש בקצה פיפטה קטן כדי לדחוף את מובילי החוט Pt:Ir הלא מבודדים אל הקיר הפנימי של השרוול. לאחר שהמובילים נמצאים במקומם, חתוך את קצות החוטים המשתרעים מחורי עופרת 2 ו-4 כך שכ-1 מ"מ של חוט משתרע מעבר לחלק החיצוני של דופן השרוול.
   9. קפלו את זנבות החוט בגודל 1 מ"מ שטוחים כנגד המשטח החיצוני של השרוול, והקפידו לא לקצר אותם יחד. מרחו כמות קטנה של דבק לריפוי UV רק כדי לכסות את שני הזנבות ולרפא את הדבק כדי לאבטח את מיקום העופרת ולספק בידוד חשמלי.
      זהירות: חשוב לכסות במלואם את משטחי ה-Pt:Ir החשופים חיצונית בדבק כדי לבודד את החוטים ולמנוע גירוי מחוץ למטרה.
4. אבטח את מובילי החוט Pt:Ir במקומם עם אבטחת תפרים.
   1. הסר את המחט הגדולה עם מכלול השרוול מלוח הקצף. הכנס תפר באורך 3 ס"מ של 6/0 דרך עין המחט ומשוך את המחט דרך הצינור כדי להשחיל את התפר דרך החלק התחתון של השרוול בנקודת האמצע.
   2. עבור למחט התפירה הקטנה כדי להשלים את השחלת התפרים לאבטחת עופרת Pt:Ir. הכנס את המחט דרך אותו חור בקו האמצע, ועבוד שוב מבפנים לחוץ כדי למנוע עיוות של הצינור ומובילי החוט. הכנס את הזנב החיצוני של התפר דרך עין המחט ומשוך את המחט דרך דופן השרוול כדי ליצור לולאת תפר סביב קצה השרוול (איור 1C).
      הערה: השתמש במלקחיים ועבוד מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח שהתפר מכוון לאורך הציר הארוך של השרוול ושוכב שטוח כנגד הצינור. שלב זה מבטיח שהמובילים יישארו מופרדים בצד הפנימי של השרוול ומוחזקים במקומם לרוחב קו האמצע של השרוול.
   3. צור לולאה שנייה סביב הקצה הנגדי של השרוול על ידי קשירת קצות התפר בחצי קשר, בצד החיצוני של השרוול. ודא שהתפר עובר לאורך הציר הארוך של השרוול ומונח שטוח על הצינור. תוך כדי החזקת הקשר בחוזקה כך שהוא מונח שטוח על הצינור, מרחו כמות קטנה של דבק ריפוי UV על חצי הקשר ורפאו כדי להחזיק במקומו.
   4. חותכים בזהירות את קצות חוט התפר קרוב ככל האפשר לקשר. במידת הצורך, השתמשו בכמות קטנה של דבק ריפוי UV נוסף כדי להדביק את הקצוות הקצרים של התפר כך שהם מונחים שטוחים על הצינור (איור 1D).
5. הלחמו את פיני המחבר למוליכי החוטים Pt:IR.
   1. בעזרת מצית בוטאן, הסר את הבידוד מ~3 מ"מ בסוף כל אחד ממוליכי החוט Pt:IR. הלחמו את צד הכוס של סיכת זהב (ראה טבלת חומרים) לקצה הלא מבודד של כל עופרת.
6. בדוק את העכבה של המכשיר המורכב.
   1. חבר את פיני הזהב לכניסות של מד השראות (L), קיבול (C) והתנגדות (R)) או מודול בדיקת עכבת אלקטרודה LCR (Inductance (L), קיבול (C) או מודול בדיקת עכבת אלקטרודה והגדר את תדר הבדיקה ל-1 קילו-הרץ. טבלו את צינור השרוול (ומגעי גירוי Pt:Ir פנים השרוול) בכוס קטנה מלאה במי מלח, תוך הקפדה על סיכות עופרת הזהב ומחברי הבדיקה יבשים. ודא שלשרוול המורכב יש עכבה ב-1 קילו-הרץ של פחות מ-2 kΩ לפני שתמשיך בהשתלה.
      הערה: עכבה גבוהה מעידה לעתים קרובות על שטח פנים לא מספיק של Pt:Ir חשוף, מה שעלול להיווצר עקב גורמים כגון הסרה לא מספקת של בידוד, מריחה מקרית של דבק בחלק הפנימי של השרוול, גדילי חוט שבורים, וכו. יש לבדוק את האזיקים גם לאיתור חוטי תיל שבורים או ממוקמים בצורה גרועה שעלולים לגרום למגעים קצרים בשימוש ארוך טווח.

2. בניית כובע ראש

הערה: נהלי הרכבת כובע הראש דומים לאלה שפורסמו בעבר ומסוכמים כאן מטעמי נוחות.

1. הרכיבו את מכסה הראש
   1. חותכים שתי חתיכות קטנות של עטיפת חוט 30 AWG (מד חוט אמריקאי), אחת ~ 13 מ"מ באורך ואחת ~ 10 מ"מ אורך. הסר את ~1.5 מ"מ הבידוד מכל קצה של שני החוטים. הלחמו את צד הסיכה של סיכת זהב לקצה אחד של כל חוט, קרוב ככל האפשר לכוס. השתמש בחותכי תיל כדי לחתוך אורך עודף של סיכה מעבר למפרק ההלחמה.
   2. הלחמו את הקצוות האחרים של חוטי ה-AWG לשתי כוסות ההלחמה המרכזיות של מחבר מיקרו-פס בעל 4 פינים.
   3. כופפו את מכסה החוט כלפי מעלה לכיוון המחבר והניחו את פיני הזהב שטוחים כנגד המחבר, במקביל זה לזה, כפי שמוצג באיור 2A. יש למקם את הסיכה המחוברת לחוט הקצר יותר מתחת לסיכה המחוברת לחוט הארוך יותר. השתמש באקריליק ציפורניים, מלט דנטלי או דבק לריפוי UV כדי לאבטח את מובילי מכסה הראש במקומם.

3. שימוש במכשיר

1. השתל את אלקטרודות השרוול לגירוי כרוני של עצב הנרתיק.
   הערה: כל ההליכים הכירורגיים צריכים להתבצע בטכניקה סטרילית או אספטית בהרדמה מתאימה, בהתאם להנחיות ה-NIH (המכונים הלאומיים לבריאות) לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ובאישור IACUC (ועדה מוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים). ההליכים הבאים נועדו להמחיש שימוש מייצג במכשיר ואינם מיועדים להיות מקיפים.
   1. הנח את החולדה במסגרת סטריאוטקסית ובצע חתך סגיטלי מעל העצמות הקודקודיות והעורפיות כדי לחשוף את משטח הגולגולת להשתלת מכסה הראש/מחבר. קדחו בזהירות 4 חורים בגולגולת והניחו את הברגים של התכשיטן. השתמש באקריליק דנטלי כדי להדק את מכסה הראש לגולגולת ולברגים.
   2. הסר את החולדה מהמסגרת הסטריאוטקסית והניח אותה על צדה הימני. בצע חתך אנכי בעור בצד שמאל של הצוואר, ונתח בזהירות את עצב הנרתיק השמאלי מעורק הצוואר, הממוקם בין שרירי הסטרנומסטואיד והסטרנוהיואיד ומתחת לשריר האומוהיואיד.
   3. מנהרה השרוול מוביל תת עורית לכיוון הגולגולת. חבר את המוליכים למכסה הראש באמצעות סיכות הזהב.
   4. הנח את עצב הנרתיק בתוך השרוול ואבטח את המכשיר סגור על ידי קשירת קשר כפול בתפרי השרוול. היזהר להימנע מפגיעה בעצב במהלך ההשתלה על ידי מניפולציה של העצב עם ווים קהים ולא מוליכים או על ידי אחיזה ברקמת חיבור המקיפה את העצב.
   5. בדוק את השתל על ידי הפעלת גירוי על המכשיר (רכבת של 10 שניות של 0.8 mA, 30 הרץ, 100 מיקרון פולסים דו-פאזיים). השתלה נכונה תביא להפסקת נשימה ולירידה ב-SpO₂ (ריווי חמצן נימי היקפי) של 5% ומעלה.
   6. מכסים את סיכות הזהב והמובילים החשופים באקריליק דנטלי, סוגרים פצעים עם תפרים ומנקים את אתרי החתך עם תמיסת מלח, אלכוהול ופובידון יוד.
   7. לספק נוזלים חלופיים, משככי כאבים וטיפול לאחר הניתוח בהתאם להנחיות ה-NIH ואישור IACUC.
2. לעורר את עצב הנרתיק במהלך התנהגות ערה.
   הערה: מתן VNS (גירוי עצב הנרתיק) כאשר בעלי חיים מבצעים משימות מוטוריות ספציפיות הוכח בעבר כמרחיב את ייצוג המפה המוטורית של שרירים רלוונטיים למשימה. אנו משתמשים בפרדיגמה מאומתת זו כדי לספק דוגמה מייצגת לשימוש במכשיר, אך פרדיגמות התנהגותיות ו/או פרמטרים רבים אחרים של גירוי עשויים להיות רלוונטיים ליישומים חלופיים. חולדות אומנו להיות מיומנות במשימת לחיצת המנוף המשמשת כאן לפני השתלת המכשיר. לאחר הניתוח, ביצועים טובים אומתו שוב לפני מתן VNS: חולדות ביצעו לפחות 100 ניסויים מוצלחים בשני אימונים של 30 דקות ביום. VNS הוצמד ללחיצות ידית נכונות במהלך 10 אימונים עוקבים במשך 5 ימים.
   1. חבר את החולדה למחולל גירויים באמצעות כובע ראש מושתל והתאם להגדרות הגירוי המתאימות. לארגון מחדש המושרה על ידי VNS של מפת קליפת המוח המוטורית, התאם כל לחיצת מנוף נכונה עם רכבת אחת של 15 פולסים דו-פאזיים, כל אחד ברוחב של 100 מיקרון ומשרעת של 800 μA, המועבר בתדר של 30 הרץ.
   2. רכבת גירוי מועברת מיד לאחר זיהוי כל לחיצת ידית מוצלחת לאורך עשרה אימונים של 30 דקות. במהלך מתן VNS, השתמש באוסילוסקופ כדי לעקוב אחר האספקה המוצלחת של גירוי זרם.
3. לאמת את תפקוד השרוול המושתל באופן כרוני.
   1. תוך 24 שעות מהאימון המזווג האחרון של VNS, השתמש במיקרו-גירוי תוך גולגולתי (ICMS) כדי לכמת את המפה הסומטוטופית התפקודית בקליפת המוח המוטורית.
   2. לאחר השראת הרדמה למיפוי ICMS של קליפת המוח המוטורית, אמת שוב את תפקוד השרוול על ידי הפעלת רכבת של 10 שניות של 30 הרץ, גירוי זרם של 0.8 mA (פולסים דו-פאזיים של 100 מיקרון), מה שאמור לגרום להפסקת הנשימה ולהפחתה ברמות SpO₂ של לפחות 5%, בהתאם לרפלקס הרינג-ברויאר.
      הערה: בהתאם ליישום, פונקציית השרוול עשויה להיחשב מקובלת אם נצפתה ירידה אמינה של SpO₂ של פחות מ-5% או אם אמפליטודות זרם גבוהות יותר (עד 1.6 mA) מייצרות באופן אמין הפחתה של לפחות 5% ב-SpO₂. אי הבחנה בהפסקת נשימה ו/או ירידה אמינה ב-SpO₂ מעידה על כשל בשתל.

תוצאות

איור 1: הרכבת אלקטרודות השרוול המעוררות. (A) לאחר אבטחת התפרים משני צידי השרוול, ניתן להשחיל חוט Pt:Ir דרך דופן השרוול בחור #1 (ראש חץ לבן) באמצעות מחט תפירה. (B) Pt: חוט Ir מושחל כהלכה ומוכן לביטול בידוד לאחר יצירת לולאת חוט סביב קצה השרוול ...

חומרים