העברת גנים בתיווך וירוס לגרעין השבלול הגבי של העכבר לגירוי שמיעתי המושרה על ידי אור

תקציר

מקור: Kozin, E. D., et.al. הדמיה ישירה של גרעין השבלול הגבי של העכברים לגירוי אופטוגנטי של מסלול השמיעה. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים העברת גנים בתיווך וירוס לגרעין השבלול הגבי של העכבר (DCN) כדי לאפשר גירוי שמיעתי המושרה על ידי אור. וקטור ויראלי המקודד אופסין, תעלת יונים רגישה לאור, מוזרק לתוך ה-DCN לאחר קרניוטומיה ושאיפת מוח לגישה ישירה. האופסינים המבוטאים מאפשרים להפעיל נוירונים על ידי אור, ומספקים מודל לחקר תגובות מסלול השמיעה באמצעות אופטוגנטיקה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. שאיבה מוחית

1. בעזרת יניקה צרפתית 5, שאפו את החלק הצדדי ביותר של המוח הקטן השמאלי מעל ה-DCN עד שה-DCN יהיה חזותי (איור 1, פאנל ימני). הסר בערך 1/4 עד 1/3 מהמוח הקטן השמאלי. נקודת הציון העיקרית הסמוכה ל-DCN היא האמפולה של התעלה החצי עגולה העליונה.
   הערה: שאיפת המוח הקטן היא שלב המפתח של הפרוטוקול. שאיפה מכוונת של המוח הקטן מבוצעת בהצלחה רבה ביותר אם היא מתרחשת בניסיון יחיד ולא עם מעברים מרובים של היניקה מכיוון שהדבר יגרום לדימום. כדי לסייע בשאיפה, הגדר את מישור המוקד של המיקרוסקופ בעומק הצפוי של ה-CN, שיהיה מעט מרוחק לפני השטח של המוח הקטן. הגדרת מישור המוקד ל-CN תשפר את ההדמיה ותבטיח תמונה חדה.
2. לאחר השאיפה, צפויים דימומים נוספים, הצטברות נוזל מוחי (CSF) ותזוזה של המוח הקטן ב-DCN. יש להחדיר 0.5 סמ"ק של מי מלח סטריליים במהירות לתוך הגולגולת כדי למנוע קרישת דם. לאחר מכן ניתן להשתמש בשילוב של טפיחה עדינה עם נקודת שיניים ויניקה כדי לפנות נתיב להדמיה ישירה של ה-DCN. אל תיגע ישירות עם פני השטח של ה-DCN.

2. מיקרו-הזרקת לחץ להעברת גנים בתיווך וירוס והתאוששות כירורגית

1. לאחר שה-DCN נקי מדם ו-CSF ונראה בבירור, בצע מיקרו-הזרקות לחץ לתוך ה-DCN באמצעות מזרק המילטון של 10 מיקרוליטר במשך תקופה של 2 דקות.
2. הכניסו את המחט עם מיקרומניפולטור עד שהקצה כבר לא נראה מתחת לפני השטח של ה-DCN.
3. לביצועים מיטביים, השתמש במחט בגודל 33 או 34 (השתמש במזרק אטום לגז עם מחט מד 34) עם שיפוע רדוד, כגון 45°, כדי למזער טראומה קהה ולמקם את נפח ההזרקה בתוך ה-DCN, שהוא מבנה גזע מוח דק ורדוד (עובי <300 מיקרומטר).
   הערה: ניתן להשתמש במכשירי מיקרו-הזרקה אחרים. באופן אידיאלי, מכשיר ההזרקה צריך להיות גמיש מספיק כדי לאפשר כיפוף קל במידת הצורך כדי לכוון ישירות ל-DCN. יתר על כן, כאשר העכבר נע מעט לאורך ההליך עקב נשימה, המכשיר צריך להיות חזק מספיק כדי לעמוד בכמויות קלות של תנועה.

3. התאוששות כירורגית

1. מיד לאחר ההזרקה, הערך מחדש את העור ואפשר לעכבר להתאושש לפי הליך התאוששות סטנדרטי. רקמת המוח הקטן והצלקת שנותרה תמלא את החלל הנגרם על ידי שאיבת המוח הקטן. עקוב כל הזמן אחר בעלי חיים עד להשגת הכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה חזה עקוב אחר קצב הלב, קצב הנשימה, כמו גם היכולת להאכיל.
   הערה: אף בעל חיים שעבר ניתוח לא מוחזר לכלוב עם בעלי חיים אחרים עד להחלמה מלאה.
2. אם עכבר מתחיל ללכת במעגלים לאחר הניתוח (<5% מהמקרים), בדרך כלל 2-4 שעות לאחר סגירת חתך העור, הקריבו מיד את העכבר, מכיוון שסביר להניח שהוא יתקשה להאכיל. תופעת לוואי זו נובעת ככל הנראה משאיפת המוח הקטן. יש לעקוב אחר הכאב של בעל החיים לאחר הניתוח, ולתת תרופות נרקוטיות מתאימות כדי להבטיח נוחות לבעלי חיים על בסיס סטנדרטים מוסדיים. ייתכן שיהיה צורך באנטיביוטיקה, אם יש עדות לזיהום.

תוצאות

איור 1: שאיבת מוח קטן חלקית מדגימה גישה לגרעין השבלול הגבי. פנל שמאלי: לאחר הנחת העכבר במחזיק, נעשה חתך אנכי דרך העור והרקמה הרכה לאורך ההיבט האחורי של הגולגולת לרקמה הרכה של הצוואר. העור עובר לרוחב, והשריר המכסה את קו התפר העטרתי מוסר. ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מחזיק סטריאוטקסי	Stoelting	51500
5 יניקה צרפתית	סימטריה כירורגית	2777914
נקודות שיניים	הנרי שיין	100-8170
Bone rongeur	Fine Surgical Tools	16020-14
10 μl מזרק המילטון	Hamilton	7633-01
34 gauge, needle	המילטון	207434
Rongeurs	Fine Surgical Tools	16021-14