גירוי עצב תועה במודל חולדה להפחתת התנהגות הקפאה

תקציר

מקור: Childs, J. E., et al. גירוי עצב תועה ככלי להשראת פלסטיות במסלולים הרלוונטיים ללמידת הכחדה. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים את השיטה של גירוי עצב התועה (VNS) במודל חולדה להפחתת התנהגות הקפאה. חולדות מותנות פחד מקבלות VNS במהלך חשיפה חוזרת לקול, מה שמוביל להפחתת הקפאה וחשיפת הפוטנציאל הטיפולי שלה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. התניה של פחד שמיעתי

הערה: פרוטוקול התניה זה של פחד הוא אינטנסיבי יותר מרוב הניסויים מכיוון שמטרת הניסויים הללו היא להגביר את ההכחדה. עם התניה קלה של פחד שנכבית בקלות, אפקט רצפה יכול לטשטש את השיפור הזה.

1. חיות בית במחזור אור/חושך של 12 שעות עם גישה חופשית למזון ומים. לטפל בבעלי חיים מדי יום במהלך ההתאוששות מהניתוח.
2. הקימו את מנגנון ההתניה והבדיקה, המורכב מתיבה אופרנטית השוכנת בתא מוחלש קול (איור 1C). לקופסה האופרנטית קירות פלסטיק שקופים, 20X20X20 ס"מ, ויש לה רצפת רשת נירוסטה, המחוברת לגנרטור זעזועים ברגל. השתמש באור בית לבן כדי להאיר את החדר להקלטת וידאו. השתמש בצליל רמת לחץ קול (SPL) של 9 קילו-הרץ, 85 dB כגירוי המותנה (CS).
3. הקלט התנהגות באמצעות מצלמה דיגיטלית הממוקמת בתוך החדר מעל תיבת האופרנט. הצג ונטר את ההפעלה במחשב הממוקם מחוץ לחדר ההתנהגות. שמור סרטונים לניתוח מאוחר יותר.
4. נגב תאים עם 70% אתנול לפני ואחרי כל מפגש כדי למנוע סימני ריח.
5. מצב פחד של החולדות במשך יומיים (איור 2A). ודא שהחולדות אינן מפחדות באופן טבעי מהטון על ידי הצגת 5 צלילים (9 קילו-הרץ, 85 dB, 30 שניות) ביום הראשון. ודא שרמות ההקפאה זניחות.
   1. עקוב אחר מצגות הצלילים הראשוניות עם 8 זיווגים של צליל-רגל (1 שניות, 0.5 mA) בכל אחד משני הימים הרצופים. חזור שוב על זיווגי הטון-הלם ביום השני. שנה את המרווח בין הגירוי (ISI) בין 2 ל-4 דקות, בממוצע 3 דקות לכל ניסוי. רנדומליזציה אקראית של הנקודה שבה מתרחש ההלם במהלך הצליל.
6. ביום השלישי, בדוק את חוזק הקשר בין טון להלם. השמיעו 4 צלילים עם ISI של 3, 4 או 5 דקות (4 דקות בממוצע) בהיעדר זעזועים ותעדו את התנהגות הקפיאה של בעלי החיים במהלך מצגות הצלילים ובמהלך המרווחים בין הגירוי כמדדים של תגובת הפחד המותנית (CFR).
7. ביום הרביעי, התחילו באימוני הכחדה עם גירוי עצב תועה (VNS) או VNS מזויף.
   1. חבר את החולדות לתוך הממריץ על ידי הכנסת המחברים הזכריים מהסטימולטור לאתר קלט הגירוי. הכניסו חיות לתוך החדר (איור 1A, 1C). הגדר את הסטימולטור ל-0.4 mA, רוחב דופק של 500 מיקרון ב-30 הרץ. הגדר את הגירוי למשך כולל של 30.15 שניות, החל מ-150 אלפיות השנייה לפני תחילת הצליל. הפעל בעלי חיים 4 צלילים והתאם כל מצגת טונים עם VNS או VNS מזויף.
8. בדוק מעת לעת את התקינות החשמלית של השרוול ואתר הקלט באמצעות אוסצילוסקופ.
   1. חבר את החיה כרגיל ופצל את הפלט מהסטימולטור לאוסצילוסקופ.
   2. הגדר את הטווח באוסילוסקופ כ-20 וולט עד +20 וולט והפעל גירוי. צורת הגל של גירוי 30 הרץ צריכה להיות גלויה על האוסילוסקופ. גירויים בגודל העולה על 10 וולט מצביעים על עכבה גבוהה ושרוול או חיבור שאינם מתפקדים כראוי באתר קלט הגירוי.
9. כדי לבדוק את ההשפעה של VNS על אימוני הכחדה, הפעל בדיקת CFR שנייה ביום 5. רשום את הזמן שהושקע בהקפאה במהלך מצגות הצלילים והשווה אותו להקפאת הבסיס שנרשמה במהלך בדיקת ה-CFR הראשונה.
10. נתח את הסרטונים באמצעות צופה עצמאי עיוור לתנאי הטיפול. מדוד את זמן ההקפאה במהלך מצגות צלילים באמצעות שעון עצר. הקפאה מוגדרת כחוסר תנועה מוחלט, שבמהלכו החולדה מפגינה נשימה מהירה, ראש מורכן וכפות פרושות. ניתן לפצל את ניתוח התנהגות ההקפאה לשני שלבים: במהלך הצגת הצליל ובמהלך המרווח בין הגירוי.

תוצאות

איור 1. גירוי עצב התועה והגדרת ניסוי. (A) סכמטי של ההתקנה המשמשת ל-VNS. בעלי חיים מחוברים ליחידת בידוד גירוי באמצעות מכסה ראש שממנו מובילים 2 חוטי פלטינה-אירידיום תת עורית לאלקטרודת השרוול בהתאמה אישית העוטפת את עצב התועה. (B) מיקום אלקטרודת השרוול סביב עצב הנרתיק. פוטומיקרוגרף של החתך הניתוחי ועצב הנרתיק החשוף לפני תפירה של אלקטרודת השרוול סביבו. (C) צילום של המערך שמשמש להתניה של פחד שמיעתי, כשהחיה מחוברת לממריץ.

איור 2. VNS משפר את ההכחדה של התניה של פחד שמיעתי. (A) ציר הזמן של הניסוי. ימים 1 ו-2: התניה של פחד שמיעתי, 8 צלילים של CS/הלם, גירוי בלתי מותנה (US) ליום. יום 3: מבחן פחד מותנה מראש, הקפאה נמדדה במהלך 4 מצגות טונים לא מזווגות. יום 4: טיפול, 3 קבוצות: 4 מצגות טונים בשילוב עם VNS, 4 מצגות טונים בשילוב עם גירוי דמה, 20 מצגות טונים בשילוב עם גירוי דמה (EE). יום 5: פוסט מבחן פחד מותנה, הקפאה נמדדת במהלך 4 מצגות טונים לא מזווגות. (B) אחוז הזמן שהוקדש להקפאה במהלך הצגת ה-CS ביום השלישי (D3, פסים לבנים) וביום החמישי (D5) עבור קבוצות הטיפול השונות (4 טונים + גירוי דמה, 4 טונים + VNS, והכחדה ממושכת, EE). לאחר יום אחד של אימוני הכחדה בשילוב עם VNS (פס שחור), חולדות בילו פחות זמן בהקפאה מאשר בקרות דמה. הקפאה במהלך הבדיקה שלאחר הבדיקה בקבוצת ה-EE (פס אפור) הייתה דומה להקפאה בקבוצת 4 הטונים + VNS. (C) אחוז הזמן שהושקע בהקפאה במהלך המרווחים הבין-טונים (ITI) ביום השלישי (D3, פסים לבנים) וביום החמישי (D5) עבור אותן קבוצות שמוצגות ב-B. חיות VNS הראו גם התנהגות קפיאה מופחתת מחוץ להצגת הצליל המותנה. (* p < 0.05, קווי שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Betadine	Henry Schein	69066950
מצלמה דיגיטלית - מצלמת רשת של Logitech C210		פלטינה של Logitech
	Medwire	10IR9/49T
ממריץ דופק מבודד דגם 2100	A-M Systems	720000
סינומטר 10 מגה-הרץ אוסילוסקופ ערוץ יחיד	סינומטר	CQ5010C
Extech 407730 מד רמת קול דיגיטלי 40-130 דציבלים	Extech Instruments	B000EWY67W
DSCK-C פלט כפול, שוקר מקושקש	Kinder Scientific Co

חוט אירידיום B003LVZO88