התחדשות אקסונלית בעצב הסיאטי של עכבר לאחר פגיעת ריסוק

1. חומרים וריאגנטים

1. בעלי חיים
   1. השתמש בעכברי CF1 נקבות בנות שישה שבועות במשקל 30-35 גרם לניסויים.
      הערה: העכברים שוכנו בקבוצה (5 עכברים לכלוב) בכלובים מעוקרים מאווררים בנפרד עם מצעי קלחי תירס בגודל 1/4 אינץ' וקנים מרובעים בגודל 2 אינץ' לקינון. הכלובים נשמרו במחזור מבוקר של 12 שעות אור-חושך וטמפרטורת החדר הייתה בין 19.4 מעלות צלזיוס ל-25 מעלות צלזיוס. העכברים הוזנו בתזונת מכרסמים עולמית ובמערכת אספקת מים אוטומטית.
2. מכשירים
   1. השתמש במכשירים הכירורגיים הבאים כדי לבצע את הניתוח ביעילות: מזרקים חד פעמיים (27 גרם, 1.0 מ"ל) להזרקה תוך-צפקית, קוצץ פרווה, מיקרוסקופ דיסקציה סטריאו, מלקחיים מיקרו-כירורגיים, מספריים מיקרו-כירורגיים, ועצמות קטנות וספוגים לא ארוגים מעוקרים.
      הערה: כל המכשירים והחומרים עוברים חיטוי לפני הניתוח או מעוקרים מראש על ידי היצרנים. במהלך הניתוח מרססים את המכשירים ב-75% אלכוהול כדי לשמור על סטריליות.
3. פתרונות הרדמה
   1. השתמש בתמיסת הרדמה #1 כדי לגרום להרדמה והשתמש בתמיסת הרדמה #2 לפני הזרקת גרעיני שורש הגב (DRG) כדי לשמור על ההרדמה.
      1. להכנת תמיסת הרדמה #1, יש לדלל קטמין וקסילזין במי מלח סטריליים בריכוז סופי של 10 מ"ג/מ"ל ו-1.2 מ"ג/מ"ל.
      2. להכנת תמיסת הרדמה #2, יש לדלל את האברטין במי מלח סטריליים בריכוז סופי של 20 מ"ג/מ"ל.
4. DNA Plasmid ו-RNA Oligos
   1. הכן את הפלסמידים באמצעות הערכה המסחרית בהתאם לפרוטוקולי היצרן. לדלל את ה-DNA של הפלסמיד במים סטריליים נטולי יונים לריכוז של 2.0 מיקרוגרם/מיקרוליטר.
   2. הוסף תמיסת צבע ירוק מהיר כדי להגיע לריכוז סופי של 0.005-0.01% (v/v) להדמיה טובה יותר של מתאר ה-DRG במהלך ההזרקה.
   3. ממיסים את ה-RNA המפריע הקטן (siRNA) או האוליגונוקלאוטידים של המיקרו-RNA (אוליגוס מיקרו-RNA) במאגרים המתאימים המסופקים על ידי היצרנים כדי להגיע לריכוז סופי של 50 מיקרומטר.
5. Micro-Injection Pipette
   1. משוך את הזכוכית הנימים באמצעות מושך המיקרופיפטה וחתוך את קצה פיפטת הזכוכית הנימים הנמשכת בעזרת מספריים מיקרו-כירורגיים כדי ליצור פתח בקוטר חיצוני של כ-50 מיקרומטר. לאחר מכן, עקרו את פיפטת הזכוכית תחת אור UV על ספסל נקי למשך כ-20-30 דקות.
   2. התקן את פיפטת הזכוכית המעוקרת על מחזיק הפיפטה המחובר למערכת חלוקת מיקרו-הזרקה תוך-תאית. הגדר את הפרמטרים של מערכת המיקרו-הזרקה בלחץ של 30 psi ומשך של 8 אלפיות השנייה.
6. מערכת אלקטרופורציה
   1. חבר את האלקטרודות למערכת האלקטרופורציה של גל מרובע והגדר את הפרמטרים הבאים: פולסים של 15 אלפיות השנייה ב-35 וולט עם מרווחים של 950 אלפיות השנייה עבור אלקטרופורציה in vivo.
7. תמיסת זלוף וקיבוע
   1. ממיסים את אבקת הפרפורמלדהיד (PFA) בתמיסת מלח 1x עם חוצץ פוספט (PBS) בריכוז של 4% (w/v). אחסן את תמיסת ה-PFA ב-4 מעלות צלזיוס.

2. פרוצדורות ניסיוניות

1. חשיפה כירורגית של ה-DRGs L4 ו-L5
   1. הרדמה של העכבר באמצעות הזרקה תוך-צפקית של תמיסת ההרדמה #1 שהוכנה קודם לכן (עם קטמין 100 מ"ג/ק"ג משקל גוף וקסילזין 12 מ"ג/ק"ג משקל גוף).
   2. לגלח את אזור הניתוח עם קוצץ הפרווה.
      הערה: מכיוון שיהיה ניתוח נוסף לריסוק העצב הסיאטי השמאלי, ניתן לגלח את הפרווה של הירך האחורית השמאלית בו זמנית.
   3. הנח את העכבר על השמיכה המחוממת (35.0 מעלות צלזיוס) ועקוב אחר טמפרטורת פי הטבעת באמצעות בדיקת טמפרטורה.
   4. כדי לבדוק את ההרדמה, צבטו את אצבעות הרגליים והזנב של העכבר והתבוננו בתגובות ההתנהגותיות.
   5. הדביקו את ארבע גפיו של העכבר על לוח השעם.
   6. נגב את אזור הניתוח בתמיסת יודופור ולאחר מכן השתמש באלכוהול 75% כדי להסיר את היודופור לפני חיתוך העור.
   7. יש למרוח משחה עיניים על העיניים למניעת יובש בזמן ההרדמה.
   8. לפני החתך, סמנו את שני צידי פסגות הכסל בעט טוש עדין. צייר קו המחבר בין שתי הנקודות של פסגות הכסל כדי להקל על זיהוי המיקומים של L5 DRGs.
   9. בצע חתך של 3 ס"מ לאורך קו האמצע של הגב התחתון בעזרת מספריים. יתר על כן, נתק את השרירים הטפילים, כגון musculus multifidus ו-musculus longissimus lumborum, מהתהליכים הקוצניים L3 ל-S1, וחשוף את מפרקי הפן של L4-5 ו-L5-6.
   10. השתמש במיקרו-רונג'ר כדי להסיר את מפרקי הפן של L4-5 ו-L5-6. יתר על כן, הסר את הקשת העצבית השמאלית של L4 ו-L5 כדי לחשוף את הצד הגבי של ה-DRG.
2. DRG Injection
   1. להזריק תמיסת הרדמה #2 (עם אברטין 200 מ"ג/ק"ג משקל גוף) תוך צפקית כדי לשמור על ההרדמה לפני הזרקת DRG.
   2. טען את פלסמידי ה-DNA או אוליגוס ה-RNA (1 מיקרוליטר לכל DRG) לתוך פיפטת נימי הזכוכית.
   3. הכנס את קצה פיפטת הזכוכית הנימים בזהירות לתוך ה-DRG.
   4. הזרקו בהדרגה תמיסה של 1.0 מיקרוליטר של פלסמידים של DNA או אוליגוס RNA לתוך ה-DRG באמצעות מערכות חלוקת המיקרו-הזרקה תוך תאיות (30 psi, 8 ms).
      הערה: משך ההזרקה אמור להימשך לא פחות מ-5 דקות.
3. Electroporation
   1. זרוק PBS על קצות האלקטרודות.
   2. נקו את הדימום בעזרת גזה כותנה מרובעת מעוקרת.
   3. צבט את DRG המטרה עם האלקטרודות בעדינות והחל 5 פולסים חשמליים מרובעים עם מערכת האלקטרופורציה.
   4. סגור את שכבות השריר והעור בהתאמה עם 5-0 תפרי ניילון.
   5. הנח את העכבר על שמיכה מחוממת (35.0 מעלות צלזיוס) בתשומת לב רבה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה חזה החזר את העכבר לכלוב הביתי לאחר שהתאושש לחלוטין מההרדמה.
      הערה: לוקח לעכבר כ-60 דקות להתאושש לחלוטין מההרדמה על שמיכת 37 מעלות צלזיוס. יש להמיס כדור אחד (200 מ"ג) איבופרופן ב-1,000 מ"ל מים (0.2 מ"ג/מ"ל) להאכלה יומית כדי להקל על הכאב שלאחר הניתוח.
4. Sciatic Nerve Crush
   1. יומיים או שלושה (תלוי בתכנון הניסוי) לאחר אלקטרופורציה של DRG, יש להרדים את העכבר תוך צפקי עם תמיסת הרדמה #2 (עם אברטין 400 מ"ג/ק"ג משקל גוף).
   2. הדביקו את ארבע גפיו של העכבר על לוח השעם.
   3. בצע חתך של 1 ס"מ 0.5 ס"מ לצד שמאל לאורך קו האמצע. חותכים את השרירים, כמו שריר הגלוטאוס מקסימוס ושריר הפיריפורמיס, לאורך. חשוף את קטע העצב הסיאטי בין הנקב הסיאטי הגדול יותר לחריץ הסיאטי.
   4. מועכים את העצב בעזרת מלקחיים מיקרו-כירורגיים למשך 12 שניות וסמנו את מקום הריסוק בתפר אפינוירולי ניילון 10-0. צור קשר על הממברנה הדוראלית כדי לסמן את אתר הריסוק.
   5. סגור את שכבות השריר והעור עם תפר ניילון 5-0.
   6. הנח את העכבר על שמיכה מחוממת (35.0 מעלות צלזיוס) בתשומת לב רבה עד שהוא חזר לחלוטין להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה חזה החזר את העכבר לכלוב הביתי לאחר שהתאושש לחלוטין מההרדמה.
      הערה: לוקח לעכבר כ-60 דקות להתאושש לחלוטין מההרדמה על שמיכת 37 מעלות צלזיוס. יש להמיס כדור אחד (200 מ"ג) איבופרופן ב-1,000 מ"ל מים (0.2 מ"ג/מ"ל) להאכלה יומית כדי להקל על הכאב שלאחר הניתוח.
5. זלוף עכבר, DRG וקציר עצב סיאטי
   1. יומיים או שלושה לאחר ריסוק העצב הסיאטי (תלוי בתכנון הניסוי), הרדמו את העכבר תוך צפקית עם תמיסת הרדמה #2.
   2. לחלחל את העכבר באופן טרנס-קרדי עם PBS (pH 7.4) ואחריו 4% פרפורמלדהיד קר כקרח (PFA) (pH 7.5) ב-PBS.
   3. לאחר הזלוף, הפרד את ה-DRGs יחד עם שורשי העצבים והעצב הסיאטי לפני הברך בזהירות בעזרת מיקרו-מספריים ומיקרו-מלקחיים מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה. הנח את העצב הסיאטי ישירות ב-4% PFA למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
6. הדמיה ומדידה של האקסונים החושיים המסומנים בפלואורסצנטיות
   1. הסירו את הרקמה והקרום המחוברים על העצב הסיאטי הקבוע בעזרת מיקרו-מספריים ומיקרו-מלקחיים בזהירות מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה. לאחר מכן, החלף את ה-4% PFA עם PBS ושטוף את העצב שלוש פעמים.
   2. הנח את העצב הסיאטי על שקופית ושמור אותו ישר. הוסף 80 מיקרוליטר של תמיסת אנטי-דהייה סביב העצב, ואז הניח עליו כיסוי. משטחים את כל הרקמה המותקנת בלחץ.
   3. הנח את הרקמות המשוטחות על המיקרוסקופ האפיפלואורסצנטי ההפוך המצויד באביזר לרכישת פסיפס ועיבוד תמונה.
      הערה: אורכי העירור והפליטה הם 488 ננומטר ו-509 ננומטר. אפשר גם לצלם מספר תמונות חופפות באופן ידני ולתפור את התמונות יחד באמצעות ImageJ עם התוסף Mosaic.
   4. בעת מדידת אורך האקסונים המתחדשים, עקוב אחר כל האקסונים המסומנים פלואורסצנטית הניתנים לזיהוי בעצב הסיאטי מאתר הריסוק (המסומן בתפר האפינוירולי 10-0) לקצוות האקסונים הדיסטליים.