השתלה סטריאוטקסית של תרחיף תאים עצביים בעכבר עם פגיעה מוחית טראומטית

תקציר

מקור: Furmanski, O., et al. מודל השפעה מבוקרת בקליפת המוח של פגיעה מוחית בעכבר עם השתלה טיפולית של תאים עצביים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. J. Vis. Exp. (2019)

בסרטון זה, תאים עצביים פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע המושרים על ידי בני אדם מוזרקים באופן סטריאוטקסי לגבול החומר האפור-לבן של קליפת המוח העמוקה במודל עכבר של פגיעה מוחית טראומטית. התאים המושתלים משתלבים ברקמה, ומקדמים התאוששות תפקודית ותיקון מעגלים במוח הפגוע.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. השתלה סטריאוטקסית של השעיית תאים

1. התחל בהליך השתלת תאים כ-24 שעות לאחר כריתת קרניקטומיה.
2. הכן את ציוד השתלת התאים והציוד הכירורגי
   1. מלא מזרק עם קצה החלקה של 1 מ"ל במי מלח סטריליים לשטיפת פצעים. חבר מחט 25 גרם למזרק כדי לשלוט בהשקיה.
   2. מלאו מזרק עם קצה החלקה של 1 מ"ל בתמיסת CsA (Cyclosporine A) לדיכוי חיסוני. חבר מחט של 25 גרם ומעלה למזרק CsA. מלאו מחדש את מזרק ה-CsA לפי הצורך בין הניתוחים.
   3. הכן מחטי זכוכית מפיפטות נימיות מזכוכית בורוסיליקט 1.0 מ"מ OD (קוטר חיצוני) בשיטות סטנדרטיות.
   4. השתמש בפינצטה עדינה כדי לשבור את קצות המחט לקוטר של כ-200 מיקרומטר. ודא שהפיר הגלילי של המחט אינו ארוך מ-2.5 ס"מ.
3. כייל את משאבת המזרק לשימוש עם מזרק 10 מיקרוליטר. הזן קצב זרימה של 0.2 μL/min כדי לספק נפח כולל של 2.0 μL.
4. הכן תרחיף תאי גזע פלוריפוטנטיים (hiPSC) המושרה על ידי בני אדם.
   1. בצע את כל הטיפול בתאים במכסה המנוע BSL-2 (Biosafety level-2) בתרבית תאים באמצעות טכניקות טיפול סטריליות סטנדרטיות.
   2. הכינו תרביות תאים מראש בהתאם לתנאים הסטנדרטיים שהוגדרו לסוג התא.
      הערה: הניסויים שהוצגו בהדגמה זו השתמשו בתאי פנוטיפ עצביים שונים שמקורם ב-hiPSCs.
   3. לפרק בעדינות את התאים לתרחיף של תא בודד באמצעות תמיסת ניתוק תאים, או אמצעים אנזימטיים או כימיים מועדפים אחרים.
   4. ספרו תאים בתרחיף, ולאחר מכן דללו את התרחיף ל-5 x 10⁴ תאים/מיקרוליטר במדיום תרבית תאים מינימלי (למשל, DMEM (מדיום הנשר השונה של Dulbecco)) במבחנה של 1.7 מ"ל.
   5. שים לב להערות הבאות להשתלה:
      1. שמור על התאים בהשעיה ב-37 מעלות צלזיוס למשך ההליכים.
      2. טען את המזרק רק מיד לפני ביצוע הזרקה תוך-פרנכימלית
         הערה: אם תרחיף התאים מונח על צידו, כוח הכבידה עלול לגרום לו להתיישב או להיצמד לצד המזרק, מה שמוביל לאי סדרים במספר התאים המוזרקים.
      3. הקצה ~5 x 10⁵ תאים (תרחיף של 10 מיקרוליטר) לעכבר אם מבצעים הליכי השתלת תאים מרובים ביום אחד.
5. בצע ניתוח השתלה סטריאוטקסי
   1. הנח את העכבר בתא אינדוקציה הרדמה המחובר למכשיר אידוי איזופלורן עם מקור חמצן דחוס. לגרום להרדמה עם ~3% איזופלורן ב~0.7 ליטר לדקה חמצן.
   2. הנח את העכבר במסגרת סטריאוטקסית עם חרוט אף הרדמה מחובר.
      1. קבע את הראש במקומו עם מוטות אוזניים ומוט נשיכה, כוון את הראש כך שהעצם הקדמית של הגולגולת תהיה אופקית. שמור על הרדמה של 1.5%-2% איזופלורן למשך הניתוח.
   3. בצע טיפול טרום ניתוחי והכנה אספטית
      1. מרחו משחת עיניים לחות המכילה אנטיביוטיקה על העיניים באמצעות צמר גפן.
      2. שטפו את מקום החתך במי מלח סטריליים כדי לנקות את האתר ולשחרר תפרים. מרחו בעדינות 70% אתנול בעזרת צמר גפן כדי לעקר את מקום החתך.
   4. הסר תפרים בעזרת פינצטה עדינה ומספריים עיניים. השקיית אתר ניתוח וכריתת קרניקטומיה עם מי מלח סטריליים בשפע.
      1. אם קליפת המוח מציגה מאפיינים פוסלים, כגון בקע מוגזם, שינוי צבע, כלי דם משובשים או דימום, יש לשלול את החיה.
   5. טען את מזרק השתלת התאים
      1. העבר את תרחיף התאים מהחממה של 37 מעלות צלזיוס למכסה המנוע של תרבית תאים. סובב בעדינות או הקש על הצינור כדי להבטיח תרחיף תאים הומוגני.
      2. השתמש במיקרו פיפטור כדי לטעון מתלה תאים של ~7.5 מיקרוליטר למזרק המילטון דרך קצה הבוכנה.
         1. החזק את המזרק בזווית של ~120° כשקצה הבוכנה פונה כלפי מטה. הכנס את הבוכנה, הקפד לא להכניס בועת אוויר בין המתלה לקצה הבוכנה.
      3. חבר את מכלול האטם למחט הפיפטה, ולאחר מכן חבר את המחט למזרק.
      4. דחוף את הבוכנה כדי להזיז את מתלה התא לתוך מחט הפיפטה. אם יש התנגדות ליציאת המתלים, השתמש בפינצטה עדינה כדי לשבור את קצה המחט כדי להגדיל את הקוטר.
   6. חבר את המזרק למשאבת המזרק הסטריאוטקסית. קדם את הבוכנה כדי לוודא שמכלול משאבת המזרק פועל כהלכה.
   7. העבר את המחט לקואורדינטות להזרקה.
      1. יישר את קצה המחט לברגמה. הגדר את קואורדינטות X ו- Y ל- 0. לאחר מכן העבירו את קצה המחט מעל כריתת הקרניקטומיה לרוחב של 2.0 מ"מ ו-1.0 מ"מ אחורי לברגמה. גע בקצה המחט במשטח הדורה מאטר והגדר את הקואורדינטות הסטריאוטקסיות ל-Z = 0.
      2. דחוף את הבוכנה כדי לוודא שתרחיף התא זורם כראוי לפני החדרת המחט למוח.
      3. הכניסו את המחט למוח לעומק של Z = -1.4 מ"מ. קואורדינטות סטריאוטקסיות אלה ממקמות את השתל בגבול החומר האפור-לבן של קליפת המוח העמוקה.
   8. הפעל את משאבת המזרק כדי להחדיר את תרחיף התאים. הגדר את טיימר ספסל המעבדה ל-15 דקות והפעל את הטיימר. השתמש במיקרוסקופ למרחקי עבודה ארוכים כדי לנטר את זרימת תרחיף התאים.
      1. להשקות את מקום הניתוח במי מלח סטריליים במהלך ההזרקה כדי לשמור על לחות הרקמות.
      2. לאחר 15 דקות, משוך לאט את מחט ההשתלה. להשקות את מקום הניתוח במי מלח ולסגור את החתך עם תפרים.
   9. בצע טיפול לאחר הניתוח
      1. הפסק את ההרדמה. יש לספק CsA על ידי הזרקה תת עורית לתוך קשקוש במינון של 10 מ"ג/ק"ג. הנח את העכבר בכלוב נקי ומחומם מראש לאחר הניתוח.
      2. לספק משכך כאבים אצטמינופן במי השתייה במינון של 1.0 מ"ג/מ"ל.
         הערה: לספק משככי כאבים בהתאם לפרוטוקול ההפעלה הסטנדרטי (SOP) של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) ובהתחשב במשתני תוצאות הניסוי.
      3. ספקו כלוב התאוששות מזון צ'או לח כדי לסייע בהחזרת נוזלים והתאוששות.
6. יש להמשיך בזריקות CsA יומיות במינון של 10 מ"ג/ק"ג לאורך כל תקופת ההישרדות של העכבר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1 מ"ל מזרקים	Becton Dickinson (BD)	309659
מבחנות 1.7 מ"ל	Denville	C2170
10 מיקרוליטר	המילטון	7635-01
25G מחטי מזרק Precision Glide	Becton Dickinson (BD)305122
70% אתנול			מוצר לבחירה; משתנה לפי אזור
תרחיף אוראלי אצטמינופן	טיילנול (לילדים)		לדלל ל-1 מ"ג/מ"ל במים
וופורייזר הרדמה	Vetland	0521-11-22
מטלית		לטיפול בבעלי חיים	רכישה מחנות הכלבו
Betadine	Purdue Products	NDC-67618-151-32
חמצן			מוצר לבחירה; משתנה לפי אזור
ציקלוספורין A	סיגמא-אולדריץ'	30024-100 מ"ג
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	סיגמא-אולדריץ'	D8418-500 מ"ל
DMEM	Invitrogen (ThermoFisher)	A14430-01
סרט חשמלי	3M Corporation		רכישה מחנות כלבו
פינצטה משובחת	Fine Science Tools	11254-20
מלקחיים	Fine Science	Tools 91106-12
פיפטות נימיות מזכוכית, 1 מ"מ OD, 0.58 מ"מ ID	World Precision Instruments	1B100F-3
ערכת מיקרו-מנוע סיבובי במהירות גבוהה	Foredom Electric Co.	K.1070 - K.107018
סט מיקרו מקדחה אידיאלי של 5	נקודות תא מדעיות	60-1000
אימפקטור סטריאוטקסי אחד עבור CCI	Leica Biosystems	39463920
Isoflurane	Baxter	NDC-10019-360-60
טיימרים לספסל מעבדה	פישר סיינטיפיק	14-649-17
מיקרופיפטה מושך	MicroData Instruments, Inc.	PMP-102	כל חולץ יספיק
להחלקות כיסוי מיקרוסקופ	פישרברנד	12-545-E
		הרכבה שקופיות מיקרוסקופ	מוצר לבחירה
מראה			רכישה מחנות כלבו
מחזיק מחט hemostat	Fine Science Tools	12002-12
עיניים משחה	Falcon Pharmaceuticals	NDC-61314-631-36
מספריים קפיציים עיניים	Fine Science Tools	15018-10
קופסת			רכישה מחנות כלבו
גליל			רכישה מחנות כלבו
משאבת מזרק ממונעת QSI	Stoelting	53311
התאמת דחיסת מחט נשלפת	המילטון	55750-01
מסגרת סטריאוטקסית למכרסמים קטנים	Stoelting	51925
מספריים קטנים	Fine Science	Tools 14060-09
StemPro Accutase	Invitrogen (ThermoFisher)	A1110501
רפידות הכנה לאלכוהול סטריליות	Fisherbrand	06-669-62
צמר גפן סטרילי/קנדל Q-tips	Tyco Healthcare	540500
מי מלח	סטריליים Hospira	NDC-0409-1966-07
שעוני עצר (2)	פישר סיינטיפיק	06-662-56
שקופיות מיקרוסקופ זהב Superfrost Plus Fisherbrand		15-188-48
תפרים - 5.0 משי עם מחט מעוקלת	אואזיס	MV-682

דחוס מדיום פלסטיק פלסטיק