התמרה לנטי-ויראלית של תאי אב עצביים לוויסות אפיגנטי של ביטוי אלפא-סינוקלאין

תקציר

מקור: Tagliafierro, L., et al. פלטפורמת וקטור לנטי-ויראלית לאספקה יעילה של כלים לעריכת אפיגנום למודלים של מחלות שמקורן בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את ההתמרה הלנטיוויראלית של תאי אב עצביים (NPCs) לשינוי אפיגנטי ממוקד של אלפא-סינוקלאין, חלבון מפתח במחלת פרקינסון. הפרוטוקול מאפשר מתילציה של DNA בתיווך מתילטרנספראז, ומפחית את ביטוי SNCA לחקר ויסות גנים והתערבויות טיפוליות פוטנציאליות.

פרוטוקול

1. התמיינות של תאי אב עצביים דופמינרגיים

1. הפשרת MD NPCs (תאי אב עצביים דופמינרגיים במוח האמצעי)
   1. הכן צלחת מצופה BMM (קרום מטריצה בסיסי) וחם N2B27 שלם. הוסף 10 מ"ל DMEM/F12 חם לצינור חרוטי של 15 מ"ל. הנח קריוביאל בבלוק חום של 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
      1. העבר את התאים מהקריוביאל לצינור המכיל DMEM/F12. צנטריפוגה ב -300 x גרם למשך 5 דקות.
      2. שאפו את הסופרנטנט, השעו מחדש את התאים ב-2 מ"ל של N2B27, והוסיפו את תרחיף התאים לבאר אחת של הצלחת המצופה BMM. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.

2. התמרה של MD NPCs וניתוח שינויי מתילציה

1. טרנסדוקציה של MD NPCs
   1. התמרת MD NPCs במפגש של 70% עם RNA מדריך LV (וקטור לנטי-ויראלי)/וקטורים מושבתים Cas9-DNMT3A (DNA methyltransferase enzyme 3A) ב-MOI (ריבוי זיהום) = 2. החלף את ה-N2B27 הבינוני 16 שעות לאחר התמרת.
   2. הוסף N2B27 עם 5 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין, 48 שעות לאחר ההעברה. תרבית התאים במשך 3 שבועות ב-N2B27 בתוספת פורומיצין כדי לקבל את קווי ה-MD NPC היציבים. התאים מוכנים ליישומים במורד הזרם (DNA, RNA, אנליזות חלבונים, אפיון פנוטיפי, הקפאה ומעבר).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ציוד
15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים	קורנינג	430791
צלחות 6 בארות צנטריפוגה	Corning	3516
Allegra 25R	בקמן קולטר	369434
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך	Leica	DM IRB2
ריאגנטים
תמיסה אנטיביוטית-אנטי-פטרייתית, תוסף 100X	Sigma Aldrich	A5955-100ML
B-27 (50X), מינוס ויטמין A	Thermo Fisher Scientific	12587010
קורנינג מטריג'ל hESC מוסמך מטריקס	קורנינג	08-774-552
DMEM-F12	Lonza	12-719
N-2 תוסף (100X)	Thermo Fisher Scientific	17502001
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	21103049

שולחנית לתרבית תאים