התמרה ויראלית ברחם בעכבר

תקציר

מקור: Lutz, D., et al. הערכת פרמטרים של נוירופלסטיות אולטרה-מבנית לאחר התמרה ברחם של מוח העכבר וחוט השדרה המתפתחים. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים התמרה ויראלית באמצעות הזרקה תוך רחמית בעוברי עכברים. מכינים עכברה בהריון לניתוח, ומבצעים חתך בקו האמצע כדי לחשוף את קרני הרחם. תערובת של וירוס המכיל את הגן הרצוי וצבע מעקב מוזרקת לעוברים בתוך שקי הרחם במיקומים הממוקדים. לאחר מכן מחזירים את קרני הרחם לפני התפירה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. בהתמרה

רחמית

1. הכן קידוד וירוס מסוג 1 הקשור לאדנו (AAV1) למטרה הרצויה (4 x 10¹¹ חלקיקים נגיפיים / מיקרוליטר של AAV1) בתמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) ב- pH 7.4. מוסיפים 0.1 מ"ג/מיקרוליטר Fast Green ושומרים על תערובת AAV1-Fast-Green ב-37 מעלות צלזיוס.
2. הכן קצה נימי דק בצורה הרצויה (אורך 8 מ"מ, בקוטר חיצוני של 80 מיקרומטר וקוטר פנימי של 50 מיקרומטר) באמצעות מושך מיקרופיפטה (הגדרות: לחץ = 500, חום = 700, משיכה = 0, מהירות = 80, זמן = 200, ראה טבלת החומרים). שוברים את קצה הנימים כך שיהיה 4-5 מ"מ.
3. הרכיבו צינור שואב (44 ס"מ על 0.7 ס"מ) עם קצה הנימים ושאבו 15 מיקרוליטר מתערובת AAV1-Fast-Green לתוך הנימים.
4. שמור על בעלי החיים בטמפרטורת גוף פיזיולוגית קבועה של 37 מעלות צלזיוס לאורך כל ההליך.
5. הכניסו עכבר C57Bl/6 בהריון (יום עוברי 14.5) לתוך תא הדגירה והרדימו את העכבר עם איזופלורן גזי של 4% (עם קצב זרימת אוויר נפחי של 0.6-0.8 ליטר לדקה).
6. תת עורית, יש להזריק בופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג משקל גוף).
7. הנח את העכבר המורדם על צלחת הניתוח המחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס).
8. כסו את העיניים בחומר סיכה.
9. התקן את העכבר עם מסכת ההרדמה (1.5% איזופלורן גזי בקצב זרימת אוויר נפחי של 0.6-0.8 ליטר לדקה) על צלחת הניתוח וגלח את אזור עור הבטן. נגב את האזור המגולח עם אתנול 3X 75% ולאחר מכן עם תמיסת בטדין.
   הערה: עקוב אחר התנהגות הנשימה של העכבר המורדם ברציפות. התאם את ריכוז גז האיזופלורן בהתאם לדפוס השאיפה-נשיפה של העכבר.
10. בדוק אם אין רפלקס פלנטרי על ידי סחיטת פלנגות הכפות האחוריות של העכבר.
11. פתח את חלל הבטן על ידי אחיזת העור במלקחיים משוננים מעוקלים (10 ס"מ) וחיתוך העור לאורך הלינאה מדיאנה עם מספריים טונגסטן קרביד ישרים (10 ס"מ), ולאחר מכן, על ידי אחיזת דופן הצפק בפינצטה ישרה של דומונט (12 ס"מ, 0.2 מ"מ x 0.12 מ"מ) וחיתוך הקיר לאורך הלינאה אלבה עם מספריים ישרים של ואנה (8 ס"מ).
12. הניחו חתיכת סרט פרפין על פתח הבטן וקבעו את הסרט משני הקצוות בעזרת מלקחיים המוסטטיים מיקרו-יתושים (12.5 ס"מ, מעוקל).
13. חשפו את קרני הרחם בעזרת מכשיר דמוי כפית כדי למנוע נזק לעוברים בתוך קרני הרחם. טפטפו כמה טיפות של PBS (37 מעלות צלזיוס) על קרני הרחם ובדקו את העוברים לאיתור נזק או מומים בתוך שק הרחם.
14. תעד את הסדר והמיקום של העוברים בקרני הרחם. סובב את העוברים בזהירות בתוך שק הרחם עד שמגיעים למיקום הרצוי להזרקה.
15. הזרקו 1-2 מיקרוליטר מתערובת AAV1-Fast-Green על ידי בדיקה ויזואלית של מקום ההזרקה (למשל, חדרי המוח) וחדירת הצבע תחת סטריאומיקרוסקופ.
16. תעד את העוברים המוזרקים והנח את קרני הרחם עם העוברים המוזרקים בחזרה לחלל הבטן.
17. טפטפו כמה טיפות PBS (37 מעלות צלזיוס) לתוך חלל הבטן. סגור את החלל על ידי תפירת דופן הצפק (השתמש בתפרים בגודל פוליאמיד 6-0) ואת העור (השתמש בתפרים בגודל פוליאמיד 3-0) באמצעות מלקחיים המוסטטיים של יתושים של הלסטד (12.5 ס"מ, מעוקל). לחלופין, השתמש בדוגמה פשוטה או בתפרים/סיכות נירוסטה כדי לסגור את חלל הבטן והעור.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
26Gx 1'' מחט	Henke-Sass, Wolf GmbH
410 יחידת הרדמה למשאבת אוויר	מכשירים ביו-רפואיים (Univentor)	8323102
סרוטיפ 1 של נגיף הקשור לאדנו (AAV1)	UKE (ויראלי מתקן ליבה)	-	להפניות ואזורי יעד של AAV1 ראה: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ וגם: וקטורי העברת גנים מעצבים: הנדסה מולקולרית ואבולוציה של וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו להעברת גנים משופרת. קוון אני, שאפר DV. Pharm Res. 2008 מרץ; 25(3):489-99. וקטורים נגיפיים רקומביננטיים AAV פסאודוטיפ עם קפסידים נגיפיים מסרוטיפים 1, 2 ו-5 מציגים יעילות דיפרנציאלית וטרופיזם תאים לאחר מסירה לאזורים שונים של מערכת העצבים המרכזית. בורגר C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. אוגוסט 2004; 10(2):302-17. וקטורים רקומביננטיים של נגיף אדנו-קשור (scAAV) משלימים את עצמם מקדמים התמרה יעילה ללא תלות בסינתזת DNA. מקארתי DM, מונהאן PE, סמולסקי RJ. ג'ין תר. אוגוסט 2001; 8(16): 1248-54.
משאבת אוויר	מכשירים ביו-רפואיים (Univentor)	Eheim 100
Aspirator tune assemblies	Sigma-Aldrich	A5177-5EA
מסכת נשימה עכבר אלומיניום אנודייז	מכשירים ביו-רפואיים (Univentor)	-
Buprenorphine	Temgesic	ampules	משכך
כאבים נימים	מדע-מוצרים	GB100TF-10	עם פינצטה דומונט
(#3, 12 ס"מ, ישר, 0.2 x 0.12 מ"מ)	FST	11203-23
מכונת גילוח חשמלית	פיליפס	-
תפרי אתיקון (אתילון, 6-0 ו-3-0)	לעיניים אתיקון-פוליאמיד
	Bepanthene	-
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7252	להדמיה של נוזלים מוזרקים
מתג ניתוב גז 4/2	מחברים מכשירים ביו-רפואיים (Univentor)	8433020
מלקחיים המוסטטיים של יתושים Halsted (12.5 ס"מ, ישר)	FST	13011-12
קופסת אינדוקציה לעכברים עם מכסה נע אופקית. מידות פנימיות: LxBxH: 155x115x130 מ"מ. עובי דופן: 6 מ"מ	מכשירים ביו-רפואיים (Univentor)	-
מלקחיים לקשתית (10 ס"מ, מעוקל, משונן)	FST	14007-14
מספריים לאיריס (11 ס"מ, ישר, טונגסטן קרביד)	FST	14501-14
Isofluran OP Tisch, מחומם חשמלית, smמידות חיצוניות: 257x110x18 מ"מ. אזור חימום: 190x90 מ"מהסרת האיזופלורן הנמלטת ממסכת הנשימה היא כלפי מטה בהתאם לתקנות	מכשירים ביו-רפואיים (Univentor)	-
Isoflurane (Attane)	JD		אינהלציה
מיקרוסקופ אור בסיסי DM E	Leica-4x		(N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (NA 1.25 ∞/0.17) מטרות
משיכת מיקרופיפטה	Science-Products	P-97
מלקחיים המוסטטיים נגד יתושים (12.5 ס"מ, מעוקלים)	FST	13010-12
Thermopuller P-97	Sutter Instruments
Tygon 6/4 חומר צינורות לחיבור כל החלקים קוטר חיצוני: 6 מ"מ קוטר פנימי: 4 מ"מ עובי קיר: 1 מ"מ	מכשירים ביו-רפואיים (Univentor)
מספריים Vannas (8 ס"מ, ישר)	FST	15009-08

חומר סיכה הרדמה רפואית