הזרקה סטריאוטקטית של הידרוג'ל לדגם עכבר לאחר שבץ מוחי

תקציר

מקור: Wilson, K.L., et al. הזרקת פיגומי הידרוג'ל ביו-חומריים למוח לאחר שבץ מוחי. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים את ההזרקה הסטריאוטקסית של הידרוג'ל לליבת השבץ של עכבר לאחר שבץ מוחי, ומדגיש את תפקידו ביצירת פיגומים המחקים את המטריצה החוץ-תאית, מקדמים חדירה תאית ותומך באנגיוגנזה, תוך הדגשת הפוטנציאל הנוירותרפי שלו בהתאוששות משבץ מוחי.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

הזרקת הידרוג'ל או ביו-חומרים אחרים

1. בצע הזרקה של ביו-חומרים בזמן המוגדר על ידי המשתמש. בניסוי זה בוצעו זריקות בין 5 ל-7 ימים לאחר השבץ. מוזרק 2 - 6 מיקרוליטר הידרוג'ל.
   1. הפעל את כרית החימום כדי לשמור על טמפרטורת גוף העכבר במהלך ההרדמה (37 מעלות צלזיוס).
   2. הכינו מספריים חיטוי, מלקחיים, כותנה, משחת עיניים וטרינרית, דבק כירורגי או חומר תפרים, אלכוהול סטרילי ומגבוני בטא יוד. הכן את מקדחת העצם עם ראשי מקדחים סטריליים ומזרקי המילטון מזכוכית 25 מיקרוליטר עם מחטי מתכת 30 גרם.
   3. הפעל את עיקור החרוזים ל -160 מעלות צלזיוס כדי לאפשר עיקור מכשירים בין עכברים.
   4. חבר את משאבות ההזרקה למכשיר הסטריאוטקסי. הגדר את קצב הזרימה ל-1 μL/min והגדר את עוצמת הקול ל-4 μL.
   5. הכינו כלוב נקי לעכברים לאחר הניתוח.
2. הכניסו את העכבר לתא האינדוקציה עם ריכוז איזופלורן של 4% כדי להרדים אותו עד שהתנועה הספונטנית תיפסק והנשימה שלו תגיע לקצב איטי ויציב.
   1. לאחר השינה, העבר ואבטח את העכבר להתקן הסטריאוטקסי עם ריכוז איזופלורן תחזוקה של 1.5%.
   2. מרחו את משחת העיניים הווטרינרית על שתי העיניים.
   3. גלחו כל פרווה שאולי צמחה מחדש מראשו של העכבר, והכינו את האזור באופן אספטי באמצעות מגבון אלכוהול ואחריו מגבון בטא יוד. חזור על הפעולה שלוש פעמים.
      הערה: במידת הצורך, השתמש במגבון אלכוהול נוסף בסוף כדי לנקות את כל הבטא יוד, מכיוון שהוא גורם לגירוי בעור ומוביל את העכברים לגרד את הגולגולת לאחר הניתוח.
3. בעזרת המספריים הקטנים ו/או המלקחיים, פתחו מחדש את העור מעל המוח. השתמש בכותנה עם מי מלח סטריליים או PBS (מי מלח עם פוספט) כדי לנקות כל פסולת מהגולגולת. עיגול לבן-צהוב (הקו, איור 1B) וחור הבור מהמקדחה יהיו גלויים. אם הרקמה המתה אינה נראית לעין, סביר להניח שלא התרחש שבץ מוחי. אם חור הקוצים אינו מרוכז מעל השבץ, קדחו מחדש כדי למרכזו.
4. כוון את משאבת ההזרקה מעל העכבר ונעל אותה ב-90°. נקה את המזרק עם מי מלח סטריליים או תמיסת PBS לפני הטעינה מחדש של החומר.
   1. לאחר הניקוי, פרק את מזרק הזכוכית כך שלא תהיה מחט. טען את המזרק באמצעות פיפטה עם תזוזה חיובית של 25 מיקרוליטר עם 10 מיקרוליטר הידרוג'ל (או חומר ביולוגי אחר כאן עם או בלי תאים).
   2. בעזרת בוכנת המזרק, דחפו את הג'ל עד לקדמת המזרק. לאחר מכן, הרכיבו מחדש את המזרק והמשיכו לדחוף עד שהג'ל יוצא באופן ניכר מהמחט.
5. הנח את המזרק על המשאבה. ייתכן שיהיה צורך לכוונן את החלק האחורי של המשאבה כך שהמזרק יתאים. כוונן את קצב הזרימה ל-30 מיקרוליטר לדקה, בחר נסיגה או הזרקה בהתאם לכיוון שהוא צריך לנוע, ולאחר מכן לחץ על התחל. לחץ על עצור כאשר החלק האחורי של המשאבה נמצא במיקום הנכון.
   1. הברג את החלק האחורי של המשאבה כך שהמזרק יהיה מאובטח. אם בוצעו התאמות בעבר, ודא שקצב הזרימה מוגדר בחזרה ל-1 מיקרוליטר לדקה ומוגדר להזרקה.
6. הזז את המשאבה בכיווני x ו-y כדי לכוון אותה מעל החור. הזז את המשאבה כלפי מטה בכיוון z עד שהמחט של המזרק נוגעת בחלק העליון של החור.
7. אפס את ה-Z בקונסולת התצוגה הדיגיטלית. לאחר מכן, הזז את המזרק כלפי מטה בכיוון z 0.750 מ"מ. אם המזרק מתכופף או שיש התנגדות, הגולגולת החלימה או לא נקדחה לחלוטין, ויש לקדוח אותה מחדש.
8. לחץ על התחל בקונסולת המשאבה כדי להזריק 4 - 6 מיקרוליטר של הידרוג'ל בקצב של 1 מיקרוליטר לדקה.
9. הגדר טיימר של 5 דקות כאשר המשאבה מפסיקה להזריק כדי לאפשר לג'ל להתחיל בקישור צולב.
10. לאחר 5 דקות, משוך לאט את המזרק על ידי סיבוב ה-z-nob. צפה כדי לראות אם חומר כלשהו נשלף בטעות או דולף מהחור. פתח את נעילת המשאבה והרחיק אותה מהעכבר כאשר המחט רחוקה מספיק מהגולגולת.
11. בעזרת מלקחיים, דבק כירורגי או תפרים סוגרים את העור מעל הראש. הנח את העכבר בכלוב הנקי וצפה בהתאוששותו. זה אמור לקחת בערך 5 - 10 דקות עד שהעכבר יתאושש מההרדמה.

תוצאות

איור 1: ייצוג סכמטי של ברגמה ולוקליזציה של שבץ. (A) האונות הקודקודיות נפגשות בחלק העליון ויוצרות את הברגמה. מיקום הלייזר היה מרוכז 2.0 מ"מ משמאל לברגמה. (B) אישור חזותי של שבץ וחור בקוצים נראה 5 ימים אחרי הש...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
25uL מזרק המילטון 702RN, ללא מחט	Fishcer Scientific	14824663	מזרקים המשמשים להזרקת ביו-חומרים
25uL פיפטה תזוזה חיובית	Gilson	M-25
פלטפורמת במה מתכווננת	Kopf מכשירים	901
C57BL/6 עכברים	מעבדת ג'קסון	664	גיל 8-12 שבועות
מכלול כלוב Rob	Thorlabs	ER3-P4	3 אינץ' ארוך, קוטר 6 מ"מ, 4 חבילות - להצמדת לייזר לסטרוטקס
צמר גפן	VWR	89031-288
CP 25 קצות פיפטה	גילסון	F148012
צלחת חימום	קופף מכשירים	HP-4M
IMPAC 6 מרכז הרדמה מרובה מטופלים משולב	VetEquip	901808
תכשיטים מלקחיים #5	כימיקלים GFS	46085
Miltex Adson מלקחיים חבישה,	Intefra Miltex	V96-118
מיני משאבה זרימה משתנה	תומס סיינטיפיק	70730-064	משאבה עבור פרפוזיה
גז אנתזיה מחזיק ראש	Kopf Instruments	923-B
תיבת בקרת ננו-סילון	Chemyx	10050
כותרת משאבת ננו-סילון	Chemxy	10051	חבר למכשיר סטריאוטקסי להזרקת חומר ביולוגי
מחט RN 30G PT STY 3, 0.5 אינץ'	Fishcer Scientific	NC9459562
מוטות אוזניים ללא קרע 60º	Kopf Instruments	922
Puralube Vet Ointment	Dr. Foster Smith	9N-76855
Rectal Probe Mouse	Kopf Instruments	Ret-3-ISO
Sol-M U-100 מזרק אינסולין עם 1/2 סימוני יחידה 0.5 מ"ל	VWR	10002-726	להזרקת רוז בנגל
StainTray Slide Staining System	Simport Scientific	M920-2	לצביעה של שקופיות
מכשיר סטרוטקסי	מכשירי קופף	940	מכשיר סטריאוטקסי של בעלי חיים קטנים
מלקחיים אדסון -1x2 שיניים	כלי מדע עדינים	91127-12
מלקחיים עדינים לסטודנטים - שוקיים ישרים/רחבים	כלי מדע עדינים	91113-10
בקר טמפרטורה	מכשירי קופף	TCAT-2LV
Tissue-Tek OCT תרכובת	VWR	25608-930
רקמות Vetbond Adhessive 3 מ"ל	סנטה קרוז ביוטכנולוגיה	sc-361931

סטודנט