בניית ממשק עצבי היקפי רגנרטיבי מרוכב במודל עכברוש של פגיעה עצבית

Abstract

מקור: Svientek, S. R., et al. ייצור ממשק העצבים ההיקפיים הרגנרטיבי המרוכב (C-RPNI) בחולדה הבוגרת. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מדגים את הבנייה הכירורגית של ממשק עצבי היקפי רגנרטיבי מורכב (C-RPNI) במודל חולדה של פגיעה עצבית היקפית. ההליך כולל הצמדת עצב פרונאלי שעבר טרנסקט לשתל שריר וכיסויו בשתל עור כדי לקדם התחדשות עצבית. עם הזמן, נוירונים מוטוריים ותחושתיים יוצרים מחדש קשרים בתוך השתלים, ומאפשרים היווצרות מבנים עצביים-שריריים ותחושתיים תפקודיים.

Protocol

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

הערה: לחולדות תורמות מותרת גישה חופשית למזון ומים לפני הליכי תרומת עור ושרירים. המתת חסד מתבצעת בהרדמה עמוקה ולאחריה הזרקת אשלגן כלורי תוך לבבי בשיטה משנית של פנאומוטורקס דו-צדדי. תיאורטית ניתן להשתמש בכל זן של חולדה בניסוי זה; עם זאת, המעבדה שלנו השיגה תוצאות עקביות בחולדות פישר F344 זכרים ונקבות (~200-250 גרם) בגיל חודשיים עד ארבעה חודשים. חולדות תורמות חייבות להיות איזוגניות לחולדות הניסוי.

1. הכנת השתל העורי

1. יש להרדים את החולדה התורמת בתא אינדוקציה תוך שימוש בתמיסה של 5% איזופלורן בחמצן ב-0.8-1 ליטר לדקה. לאחר הרדמת החולדה יש להוציא מתא האינדוקציה ולהניח על חרוט אף נושם, ולהוריד את האיזופלורן ל-2-2.5% לשמירה על ההרדמה.
2. יש לתת תמיסה של 0.02-0.03 מ"ל קרפרופן (50 מ"ג/מ"ל) ב-0.2 מ"ל של מי מלח סטריליים תת עורית בין השכמות לשיכוך כאבים.
3. מרחו משחת דמעות מלאכותיות על שתי העיניים כדי למנוע כיבים בקרנית.
4. בעזרת קוצץ, גלחו את כל הגפיים האחוריות התחתונות, אזור הקרסול וצידי הכפות.
5. יש לנקות את הגפה האחורית והפלנטרית הנבחרת של כפות הרגליים באלכוהול, ולאחר מכן את תמיסת היודופובידון, ולהסתיים בניקוי סופי עם אלכוהול להסרת שאריות יודופובידון.
6. בעזרת מקדחה מהירה במהירות גבוהה של מנוע מיקרו כף יד עם אבן ליטוש חצץ עדינה עגולה נשלפת (4000 סל"ד), קבור את המשטח הכף של הכפה כדי להסיר את האפידרמיס. בזמן הבור יש למרוח טפטפות מי מלח כדי לא לשרוף את העור. הדרמיס הבסיסי יהיה בעל מראה מבריק עם דימום נקודתי.
7. מרחו חוסם עורקים על הגפה התחתונה כדי להאט את זרימת הדם.
8. הסר את עור הכף בחדות בעזרת אזמל #15 והניח אותו בגזה לחה במי מלח כדי למנוע התייבשות. חלק מהרקמות הגידיות והחיבור יוסרו מטבען עם העור בשלב זה ויוסרו מאוחר יותר.
9. מרחו עטיפת גזה על כף הרגל המדממת כדי להאט את הדימום. חזור על שלבים 1.5-1.9 אם אתה מבצע שני מבנים.
10. תחת מיקרוסקופ (הגדלה פי 20), הסר את רקמת הגידים והחיבור מהשכבה העמוקה של שתל העור באמצעות מספריים. הקפד לא לעשות חורים בשתל. השתל העורי הדק צריך להיות מעט אטום המכיל רק דרמיס, בגודל של כ-0.5 ס"מ על 1.0 ס"מ.
11. מניחים בגזה לחה במי מלח עד שתהיה מוכנה לייצור קונסטרוקציה C-RPNI. יש להשתמש בשתלים תוך שעתיים מרגע הקטיף.

2. הכנת שתל השריר

1. בצע חתך אורכי לאורך ההיבט הקדמי של הגפה האחורית התחתונה ממש מעל הקרסול ועד ממש מתחת לברך בעזרת אזמל #15. נתח דרך הרקמה התת עורית כדי לחשוף את השרירים הבסיסיים.
2. בהיבט הדיסטלי של החתך, חשוף את ההחדרות הגידיות של שרירי הגפיים התחתונות. טיביאליס קדמי (TA) הוא בדרך כלל הגדול והקדמי ביותר מבין השרירים, וממש מתחת ואחורי לשריר זה נמצא ה-extensor digitorum longus (EDL). יש לבודד את גיד ה-EDL הדיסטלי משאר הגידים באזור, ולהקפיד לא לחתוך את החדרתו בשלב זה.
3. הקפידו על בידוד הגיד הנכון על ידי החדרת שתי השיניים של מלקחיים מתחת לגיד והפעלת לחץ כלפי מעלה על ידי פתיחת המלקחיים כדי לגרום לסטייה של הגידים. מניפולציה של גיד זה אמורה לגרום לכל אצבעות הרגליים להתרחב בו זמנית.
4. בצע טנוטומיה דיסטלית עם מספריים חדים לקשתית והפרד את השריר מהרקמות הסובבות בצורה בוטה בעזרת טנוטומיה (או מספריים קהים אחרים), תוך עבודה בסמוך למציאת מקור הגידים.
5. לאחר הדמיית הגיד הפרוקסימלי, בצע שוב טנוטומיה באמצעות מספריים חדים לקשתית העינית. מניחים את שתל השריר בגזה לחה במי מלח כדי למנוע התייבשות.
6. לאחר הסרת כל השתלים הרצויים מחולדה תורמת, המתת חסד בעיקר על ידי הזרקת KCl תוך לבבית (1-2 mEq K+/kg) ואחריה המתת חסד משנית עם פנאומוטורקס ניקוב דו צדדי עם להב #15.

3. בידוד והכנה של עצב פרונאלי נפוץ

1. הרדמה ומתן משככי כאבים לחולדת הניסוי על פי הפרוטוקול המתואר בשלבים 1.1-1.3.
2. מגלחים את הירך הרצויה ומנקים באלכוהול, בטדין ומסיימים באלכוהול כדי להסיר עקבות של בטדין.
3. העבירו את החיה משולחן ההכנה לניתוח לשולחן המיקרוסקופ הניתוחי והניחו אותה על כרית חימום עם בדיקת טמפרטורה לשמירה על טמפרטורת הגוף. שמור על איזופלורן ב-2-2.5% וחמצן ב-0.8-1 ליטר לדקה.
4. סמן את החתך, המשתרע רק מהחריץ הדיסטלי לחריץ הסיאטי לחלק התחתון של הברך. סימון זה צריך להיות נחות מעצם הירך ומרוחק ממנו. בצע את החתך בעזרת להב #15, חותך דרך שריר הזרוע הבסיסי של עצם הירך.
5. נתח בזהירות דרך שריר הזרוע עם המוסטט או מיקרומספריים קהים לחלל שמתחת לשריר הזרוע.
   הערה: העצב הסיאטי נע בערך באותו כיוון כמו החתך הראשוני שנעשה. ישנם שלושה ענפים, בדרך כלל כאשר העצב הסוראלי האחורי והעצב הפרונאלי והטיביאלי המשותף נעים שטחיים ועמוקים עד הברך, בהתאמה.
6. לאחר זיהוי העצב הפרונאלי המשותף (CP), באמצעות זוג מלקחיים מיקרו-עדינים ומיקרו-מספריים, בודד בזהירות את עצב ה-CP מהענפים הסיאטיים האחרים והסר כל רקמת חיבור שנותרה דיסטלית.
7. בנקודה בה העצב חוצה את פני הברך, יש לחצות את העצב בחדות בעזרת זוג מספריים.
   הערה: שימוש במספריים חדים חשוב ביותר בשלב זה, שכן גרימת טראומה משמעותית לעצב עלולה להגביר את הסיכון להיווצרות נוירומה.
8. שחרר בזהירות את כל רקמת החיבור שנותרה מעצב ה-CP ועבוד קרוב כדי לשחרר את העצב לאורך של כ-2 ס"מ.

4. ייצור מבנה C-RPNI

1. הסר את שתל השריר מגזה לחה במי מלח והסר את כל רקמת הגידים המרכזית וכן קטע מרכזי קטן של אפימיסיום. השאירו את הקצוות הגידיים שלמים.
2. שימוש ב-8-0 תפר ניילון, אבטח את האפינוריום של הקצה המועבר של עצב ה- CP לאזור שתל השריר נטול אפימיסיום עם שני תפרים קטועים משני צידי העצב.
3. אבטח את שתל השריר לעצם הירך עם תפר יחיד של 6-0 ניילון מופרע הן מבחינה פרוקסימלית והן מבחינה דיסטלית, כאשר צומת העצב-שריר פונה הרחק מעצם הירך.
   הערה: אבטח את השריר כך שיהיה באורך רגיל ורגוע. נסו לא למתוח את השריר באופן משמעותי או להשאיר יותר מדי רפיון בעת האבטחה.
4. מקם 8-0 תפר ניילון בשוליים התחתונים והמרכזיים של אפימיסיום שתל השריר, מאבטח אותו לאפיניוריום עצב CP באופן שיוצר רפיון בעצב בתוך שתל השריר ועוזר להקל על כל מתח עתידי שהוא עלול להיחשף אליו עם אמבולציה מאוחרת יותר.
5. הסר את שתל העור מהגזה הלחה במי מלח וסדר אותה על שתל השריר בצורה שתכסה לחלוטין את העצב ואת רוב השריר. ודא שהשוליים העמוקים של הדרמיס מונחים על השריר. חתוך כל דרמיס המשתרע מעבר לגבול השריר.
6. אבטח את שתל העור לשתל השריר באופן היקפי באמצעות 8-0 ניילון קטע את התפרים. בדרך כלל משתמשים ב 4-8 תפרים בסך הכל בהתאם לגודל המבנה.
7. סגור את שריר הזרוע מעל המבנה בצורה רציפה עם תפר כרומי 5-0.
8. סגור את העור שמעל עם תפר כרומי 4-0 בצורת ריצה.
9. יש לספוג את אזור הניתוח עם פד אלכוהול ולמרוח משחה אנטיביוטית.
10. הפסיקו את ההרדמה בשאיפה ואפשרו לחולדה להתאושש עם מקורות מזון ומים בנפרד מחברי הכלוב.

Materials