הדמיה ביולומינסנט של התקדמות גידול השד במודל עכבר נקבה

תקציר

מקור:
מרינה אראנטס רדיקי¹, ויקטור קרלוס מלו¹,
ויקטורה פאס מצ'אדו¹, מרסיה כריסטינה אוליביירה דה רושה¹, ז'קלין ואז דה אוליביירה¹, לואנה כריסטינה קמרגו^1,2, לואיס אלכסנדר מולמן¹, ריקרדו בנטס אזבדו¹, סוניה נאיר באו¹, ז'ואאו פאולו פיגרו לונגו<sup>1

1</sup>המכון למדעי הביולוגיה, אוניברסיטת ברזיליה, ²המחלקה לתהליכים פסיכולוגיים בסיסיים, המכון לפסיכולוגיה, אוניברסיטת ברזיליה

סרטון זה מדגים את ההליך למעקב אחר התקדמות הגידול in vivo על ידי הזרקת תאי אדנוקרצינומה שדיים המבטאים לוציפראז לעכבר נקבה וניטור אותות ביולומינסנט כדי להעריך את צמיחת הגידול הראשוני והגרורתי לאורך זמן

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. תרבית תאים

1. שמור על קו תאים 4T1 (ATCC-CRL-2539), תא אדנוקרצינומה של שד עכבר, בתרבית עם מדיום DMEM (מדיום הנשר המותאם של Dulbecco) בתוספת 10% סרום בקר עוברי (v:v), פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין (100 U/mL), ב-37 מעלות צלזיוס ובאווירה לחה המכילה 5% CO₂.
2. העבירו את קו התאים המקורי עם הגן Luc2, המבטא לוציפראז. אנזים ביולומינסנט זה מיוצר באופן מכונן.

2. מודל בעלי חיים - השתלת תאי גידול

1. לחסן תת עורית תאי 4T1 המבטאים לוציפראז (2 × 10⁵ תאים לעכבר) בגב השמאלי של עכברי Balb/c בהרדמה (קטמין וקסילזין ב-80 מ"ג/ק"ג ו-10 מ"ג/ק"ג, בהתאמה).
   1. לצורך הליך זה, יש להרדים את העכבר לפני הניסוי באמצעות הזרקה תוך-צפקית של חומרי ההרדמה שצוינו (קטמין וקסילזין במינון 80 ו-10 מ"ג/ק"ג, בהתאמה).
   2. לאחר 5 דקות של השראת הרדמה, יש לגלח את העכבר ולהזריק את התאים תת עורית באמצעות מזרקי אינסולין של 1 מ"ל.
      הערה: בסך הכל חמישה עכברים בני 8 שבועות, במשקל של כ-25 גרם כל אחד, שימשו לזירוז גידול והדמיה.
2. כדי לכמת את צמיחת הגידול in vivo, העריכו את העכבר נושא הגידול על ידי הדמיה ביולוגית, על ידי ניטור צמיחת הגידול במשך 4 שבועות.
   1. לניסויי הדמיה ביולוגית, יש להרדים את העכבר באיזופלורן (2.5% מדולל באוויר דחוס מטוהר). כדי להעריך את התקדמות הגידול, דמו את העכבר פעם בשבוע למשך 4 שבועות באמצעות ציוד המודד אותות ביולומינסנטים.
      הערה: האות 4T1-luc luciferase bioluminescent שימש כפרמטר להערכת צמיחה וציון התקדמות הגידול.
3. במהלך תהליך ההדמיה, מקם את העכבר במצב שכיבה גבי בתוך האזור המיועד של הציוד כדי ללכוד את התמונות הביו-לומינסצנטיות.
4. לאחר ההרדמה, יש להזריק לעכבר D-luciferin (100 מיקרוליטר; 15 מ"ג/מ"ל) תוך צפק.
   הערה: מכיוון ש-D-לוציפרין הוא סובסטרט לאנזים לוציפראז, המייצר פוטוני אור כאשר הוא נבקע, ותאי הלוציפראז 4T1-bioluminescent מבטאים אנזים זה באופן מבנה, מכמתים ומזהים את הגידול בבעלי חיים חיים.
5. כדי לזהות אותות, צלם 20 תמונות ביו-לומינסנט במשך 20 דקות עבור כל בעל חיים בכל נקודת קצה. כל אחת מהתמונות הללו מייצגת את האות הביולוגי הנפלט לאורך תקופה של 60 שניות.
6. בנה עקומת קינטיקה ביולומינסנט המייצגת את האות הנפלט בכל דקה. כדי להבטיח תוצאות מיטביות עבור כל בעל חיים, רשום את הפליטה הביולוגית המקסימלית עבור כל נקודת קצה.
7. לצילום תמונות ביולומינסנציה, השתמש בפרמטרים הבאים: מסנן פליטה פתוח, ללא עירור, binning 8, f/stop 2 ושדה ראייה מסוג D. כדי ליצור עקומת גדילה, דמיין את החיות פעם בשבוע למשך 4 שבועות בסך הכל.
8. הדמיה ביולומינסנציה - גידול ראשוני וגרורות ריאות.
   1. כדי להבחין בין אותות הגידול הראשוני לגרורות ריאה, הגדר אזורי עניין ספציפיים באמצעות תוכנת הציוד.
   2. זיהוי אותות ביולומינסנט באתר ההזרקה ובאזור בית החזה בו התאים שלחו גרורות. על סמך תמונות אלה, חשב את התקדמות האות הביולוגי, שמתאם חזק עם התקדמות הגידול.
   3. עם תמונות שנאספו במשך מספר שבועות, צור פרופיל קינטי גידול לאתרי הגידול השונים, כולל הגידול הראשוני והנגעים הגרורתיים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
די-לוציפרין	פרקין אלמר	122799	מגיב כימי
מדיום הנשר המותאם של דולבקוס	גיבקו	א7030	מדיה של תרבית תאים
סרום בקר עוברי	מרק	פ2442	תוסף מדיה לתרבית תאים
איזופלורן	Cristália	נה	חומרי הרדמה
IVIS לומינה	XR	העונה השלישית	ציוד – ארה"ב
פניצילין	מרק	עמ' 4333	אנטיביוטיקה לתרבית תאים
פלואידין-אלקסה פלואור 488	תרמו פישר	א 12379	מגיב כימי
מלח חוצץ פוספט	מרק	4437568	מגיב כימי
סטרפטומיצין	מרק	עמ' 4333	אנטיביוטיקה לתרבית תאים