מידול פגוציטוזיס מתווך משלים באמצעות תאי דם אדומים אופסוניים במבחנה

תקציר

מקור: נגרה, נ., ואחרים. פגוציטוזה של מקרופאגים אלוואולריים ופינוי חיידקים בעכברים. J. Vis. Exp. (2019).

הסרטון הזה מדגים את ההערכה של פגוציטוזיס המתווך על ידי קולטני המשלים באמצעות תאי דם אדומים של כבשים שזוהרו ב-IgM ומשלים, ולאחר מכן את קליטם על ידי מקרופאגים של עכברים. היקף הפגוציטוזה נמדד על ידי מדידת תוצר כרומוגני כחול שנוצר מחמצון דיאמינופלואורן שנוצר על ידי המוגלובין.

פרוטוקול

1. פאגוציטוזה בתיווך FcγR ו-CR

1. לצורך האופסוניזציה, דגרו 2 x^{10 8} תאי דם אדומים של כבשים (SRBCs) עם 50 מיקרוליטר של אנטי-SRBC-IgM של ארנב או 50 מיקרוליטר של אנטי-SRBC-IgG של ארנב למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
2. דגרו SRBCs עם 50 מיקרוליטר של סרום אנושי חסר C5 (C5D) למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לקבע את מקטעי המשלים C3b ו-C3bi על SRBCים מצופים IgM.
3. תאי מקרופאג' של עכברי זרעים (תאי MH-S) (10,000 תאים לבאר) בלוח של 96 בארות ודוגרים במשך הלילה כדי להגיע ל-~70% מפגשים. הוסף 100 מיקרוליטר של 1 × 10 תאי SRBC אופסוניים⁷/מ"ל לכל באר של תאי MH-S ודוגר למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. שטוף את SRBCs המשוחררים במהירות רבה (~1 דקה) עם 100 מיקרוליטר של בופר ליזיס אמוניום כלוריד-אשלגן (ACK).
4. לעבור את התאים עם 0.1% SDS והוסף 50 מיקרוליטר של 2,7-דיאמינופלואורן (DAF) המכיל 3% מי חמצן ו-6 מיליון אוריאה. מדדו את הספיגה של תצורת פלואורן כחולה עם קטליזת המוגלובין ב-620 ננומטר.
5. קבעו את מספר ה-SRBCs באמצעות עקומה סטנדרטית בערכי ספיגה של 620 ננומטר עם מספר ידוע של SRBCs. באופן דומה, תאי MH-S מעבדים מודגרים עם SRBCs לא אופסוניים לשימוש כבקרות שליליות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2,7-דיאמינופלורן (DAF)	סיגמא-אלדריץ'	D17106	ציון ביולוגיה מולקולרית
70% אתנול	Decon Labs Inc.	18C27B	דרגה אנליטית
לוח 96 בארות	קורנינג	3603	דרגת ביולוגיה תאית
מאגר ליזיס ACK	טכנולוגיות חיים	A10492	ציון ביולוגיה מולקולרית
סרום חסר C5	סיגמא-אלדריץ'	C1163	תגובת ביוכימית
צנטריפוגה	לבנט אינטרנשיונל	C0160-R
ציטוצנטריפוגה של ציטוספין 4	תרמופישר סיינטיפיק	A78300101 גיליון 11
מדיה לתרבות תאים DMEM	גיבקו	11995-065	דרגת ביולוגיה תאית
FBS	אטלנטה ביולוגיקס	S11550	דרגת ביולוגיה תאית
ציטומטר זרימה	BD ביוסיינסס	FACSCalibur
Flow Jo Software	FlowJo, LLC
מלקחיים	דומון	0508-SS/45-PS-1	מתאים לניתוח בעלי חיים במעבדה
צלחת תחתית זכוכית	MatTek Corp.	P35G-0.170-14-C	דרגת ביולוגיה תאית
מזרק בלחץ גבוה	פן-סנצ'ורי	FMJ-250	מתאים לשימוש בבעלי חיים במעבדה
הומוגנייזר	אומני אינטרנשיונל	TH-01
מי חמצן	סיגמא-אלדריץ'	H1009	דרגה אנליטית
מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך	אולימפוס	IX73
מיקרוספרייזר	פן-סנצ'ורי	IA-1C	מתאים לשימוש בבעלי חיים במעבדה
פאראפורמלדהיד	סיגמא-אלדריץ'	P6148	דרגת ריאגנט
PBS	גיבקו	20012-027	דרגת ביולוגיה תאית
ארנב אנטי-SRBC-IgG	ביומדיקל MP	55806	מתאים לבדיקות אימונו-
ארנב נגד SRBC-IgM	מעבדות סידרליין	CL9000-M	מתאים לבדיקות אימונו-
מספריים	מילטקס	5-2	מתאים לניתוח בעלי חיים במעבדה
תאי דם אדומים של כבשים (SRBCs)	ביומדיקל MP	55876	SRBC שטופים ומשומרים