הדמיית מיקום חיידקים ואינטראקציה בין המארחים ברקמת הריאה האנושית

Abstract

מקור: מילס, ב., ואחרים, סקר אופטי של גשושים ייחודיים לחיידקים חדשים ברקמת ריאה אנושית מחוץ לחיים באמצעות אנדומיקרוסקופיה בלייזר קונפוקלי. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים הדמיה בזמן אמת של סטפילוקוקוס אוראוס המסומן בפלואורסצנציה ברקמת תלייה וריאה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנציה קונפוקלית סיבית.

Protocol

1. איסוף נתונים באמצעות אנדומיקרוסקופ לייזר קונפוקלי (CLE)
   1. לאחר ההגדרה, ייפתח חלון לבחירת מיקום האחסון והקידומת של הקובץ. בחר את התיקייה הרצויה לאחסון נתונים, וקבע את שם הקידומת בהתאם.
   2. מקם את דוושות הרגל כך שהמפעיל יוכל לגשת אליהן בקלות. פדל שמאל: לייזר דלוק/כבוי; פדל מרכזי: הפסקה; פדל ימין: הקלטה/עצירה.
      הערה: בקרי הלייזר נגישים גם דרך בקרות על המסך.
   3. לחץ על 'התחל' על המסך או לחץ על דוושת רגל שמאל כדי להפעיל את הלייזר. זה יתחיל באיסוף ולקבל תמונות באמצעות 100% עוצמת לייזר וקצב פריימים של 12 פריימים לשנייה (הגדרות ברירת מחדל).
      הערה: ביישומים אחרים, ניתן לשנות הגדרות אלו על המסך במידת הצורך, בהתאם לסוג המדגם.
   4. דמיינו כל אחת מדגימות ההשעיה החיידקית.
      1. הכנס את הקצה הדיסטלי של סיב ההדמיה של FCFM (מיקרוסקופיית פלואורסצנציה קונפוקלית סיבית) והזז את הסיב לאט דרך המתלה כדי לבדוק את הדגימה.
      2. הקליטו סרטונים בכל אורך (עד 10 דקות) על ידי לחיצה על דוושת הרגל הימנית או בחירת בקרות ההקלטה על המסך, כאשר הסיב נע לאט סביב הדגימה.
      3. נקה את הקצה המרוחק של סיב ההדמיה של FCFM עם 8%_{H2O 2} וניקוי עדשה בין הדגימות. ​
         הערה: אורכי וידאו טיפוסיים של 10-30 שניות מספיקים להדמיה חוץ-גופית .
   5. דמיינו כל דגימת רקמת ריאה.
      1. הכנס את הקצה המרוחק של סיב ההדמיה של FCFM לדגימה, כדי להבטיח מגע ישיר בין קצה הסיב לרקמה. הזז בעדינות את קצה סיב ההדמיה כדי לבדוק את הדגימה.
         הערה: הרמת קצה הסיב הרחק מהרקמה תסיר את הרקמה ממישור המוקד; עם זאת, ניתן להשתמש בזה כדי לצלם חיידקים מסומנים שאינם דבוקים לרקמה.
      2. הקליטו סרטונים בכל אורך (עד 10 דקות) על ידי לחיצה על דוושת הרגל הימנית או בחירת בקרות ההקלטה על המסך, כאשר הסיב נע לאט סביב הדגימה.
         הערה: בדרך כלל, אורכי וידאו של 30 שניות מספיקים להדמיה אקס-ויבו על רקמה.
      3. נקה את הקצה המרוחק של סיב ההדמיה של FCFM עם רקמות ניקוי עדשה ו-8% H₂O₂ בין הדגימות.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-14 מיקרופוג'	SciQuip	90616	מיקרוצנטריפוגה קטנה על שולחן
לוח 96 בארות	קורנינג	3370	לוח בדיקה
קלסין AM	סיגמא אולדריץ'	17783	צבע פלואורסצנטי מסחרי
Cellvizio 488 ננומטר Research CLE	מאונה קאה טכנולוגיות	LC-0001-488	מכשיר אנדומיקרוסקופיה בלייזר קונפוקלי
קלטופ-ס	קלטופ	14110601	מנקה סיבים
אפנדורף (1.5 מ"ל)	אפנדורף	30120086	צינור מיקרופוג' 1.5 מ"ל
גיבקו פוספט עם מלח ממופר	תרמו פישר סיינטיפיק	10010023	PBS - מדיה ווש
IC-Viewer	מאונה קאה טכנולוגיות	LW-0001	תוכנת איסוף ועיבוד נתונים למערכת המחקר CellVizio 488 ננומטר
מחקר לא סטנדרטי AlveoFlex 488 ננומטר	מאונה קאה טכנולוגיות	MP-0002-AF3	סיב מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי סיבי
Quanti Kit 488 ננומטר	מאונה קאה טכנולוגיות	LQ-0005	ערכת כיול למערכת CellVizio 488
S. aureus ATCC 25923	ATCC	25923	הזן החיידקי ששימש במחקר זה
קובטה ספקטרופוטומטרית חצי-מיקרו-מיקרו	סיגמא אולדריץ'	C5416-100EA	לספקטרופוטומטריה
נוחות התרמומיקסר	אפנדורף	41102422	מחמם על הספסל עם ניעור