ניקוי סלקטיבי של תולעי Caenorhabditis להעשרת מיקרוביום המעי

תקציר

מקור: מורגן, א. ואחרים. ניקוי סלקטיבי של נמטודות Caenorhabditis בטבע להעשרת חיידקי מיקרוביום במעי. J. Vis. Exp. (2021)

הסרטון הזה מדגים פרוטוקול לבידוד חיידקי מעיים מעניינים מתולעי Caenorhabditis פראיות. התולעים מורעבות ושוטפות תחילה כדי לחסל חיידקים שאריות מזינים מפני השטח ומהמעי שלהן, תוך שמירה על המיקרובים המטרה. לאחר ניקוי פני השטח ומספר שלבים בזחילה, התולעים מנותחות כדי להוציא מעיים המכילים את החיידקים הרלוונטיים, אשר נאספים ומוקפאים לאחסון.

פרוטוקול

1. כריתה במעי וזיהוי PCR של מיני מיקרואורגניזמים

1. גידול בעלי חיים בטמפרטורה של 20°C למשך 3-4 ימים כדי לאפשר להם למות ברעב ולהפחית את כמות חיידקי OP50-1 (זן Escherichia coli OP50-1). הוסיפו 5 מ"ל מדיום M9 לצלחת התולעים הרעבות.

2. באמצעות פיפטה ונורת זכוכית סטרילית, מעלה את תולעי M9+ מהפלטה והעביר אותן לצינור צנטריפוגה סטרילי בנפח 15 מ"ל.

3. באמצעות צנטריפוגה קלינית, סובב את התולעים בצינור ב-1000 x g למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר.

4. באמצעות פיפטה סטרילית בנפח 15 מ"ל, הסרת הסופרנטנט מצינור הצנטריפוגה מבלי להפריע לתולעים החיות בתחתית הצינור.

5. מוסיפים 10 מ"ל M9 + 0.05% טריטון X-100 ודגרו את הצינור על נוטאטור למשך 20 דקות כדי להסיר מיקרובים חיצוניים. חזור על זה ארבע פעמים כדי לשטוף את התולעים.

6. לאחר השטיפה האחרונה, באמצעות קצה פיפטה סטרילית, יש להסיר את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור בתחתית ב-100 מיקרו ליטר מהתמיסה.

7. באמצעות קצה פיפטה סטרילי, העבר את M9 ואת התולעים ללוח NGM לא זרוע ומאפשר לצלחת להתייבש בזמן שהתולעים זוחלות במשך 20 דקות כדי לעזור להסיר את OP50-1 מהקוטיקולה ומהמעי.

8. להוסיף 250 מיקרוליטר M9 ללוח היבש ולהשתמש בפיפטה מזכוכית כדי להעביר תולעי M9+ ללוח NGM חדש שלא זרע. שוב, תן לצלחת להתייבש ותן לתולעים לזחול במשך 20 דקות.

9. להוסיף 250 מיקרוליטר M9 לפלטה ולהעביר 100 מיקרוליטר מתולעי M9+ לזכוכית שעון נקייה.

10. באמצעות שתי מחטי מזרק סטריליות של 26 גרם, ערפו את ראש הנמטודות על ידי החזקת התולעת עם מחט אחת ושימוש במחט השנייה לחתוך את התולעת. לאחר עריפת הראש, המעי (גרגרי) והגונד (השקוף) מהגוף יוצאים באופן טבעי מהגוף.

11. חתך חתיכה מהמעי החשוף על ידי אחיזת המעי עם מחט אחת וחיתוך עם המחט השנייה.

הערה: אם אפשר, יש לוודא שהמיקרוב המעניין עדיין קיים במעי שיצא באמצעות מיקרוסקופ נורמרסקי, הכלאה פלואורסצנטית במקום (FISH), או אימונוהיסטוכימיה.

12. להעביר מעי יחיד שנחתך לצינור PCR בנפח 0.5 מ"ל המכיל 10 מיקרוליטר מים סטריליים. חזור על התהליך לסך של לפחות 5 צינורות PCR (תגובת שרשרת פולימראז) המכילות מעיים מבעלי חיים שונים.

13. הקפיאו את צינורות ה-PCR בטמפרטורה של -80°C למשך מינימום של 5 דקות. הסר את צינורות ה-PCR מהמקפיא והפשר את הדגימות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אגרוז	פישר סיינטיפיק	BP1356
10% SDS	Invitrogen	AM9822
מחט BD PrecisionGlide - 26 גרם	פישר סיינטיפיק	305115
KH₂PO₄	פישר סיינטיפיק	P-286
NaCl	פישר סיינטיפיק	S-671
NH₄Cl	פישר סיינטיפיק	A-661
סטרפטומיצין	מיליפור-סיגמא	S6501-50G
טטרציקלין	מיליפור-סיגמא	T7660-5G
טריטון X-100	פישר סיינטיפיק	BP-151
משקפי שעון	VWR	470144-850