היברידיזציה פלואורסצנטית במקום של חיידקי מעי בחתכי מעי בעכברים

תקציר

מקור: נג, ק. מ., טרופיני, ק. הדמיית אינטראקציות בין מיקרוביוטה במעי למארח באמצעות היברידיזציה פלואורסצנטית במקום , צביעת לקטין והדמיה. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מדגים את תהליך היברידיזציה פלואורסצנטית במקום (FISH) לצביעת מיקרוביום המעי ברקמת מעי העכברים על ידי היברידיזציה של גלאי פלואורסצנטיים ל-rRNA חיידקי (חומצה ריבונוקלאית ריבוזומלית) וצביעה נגד מבני המארח לניתוח מיקרוסקופי.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הבחינה האתית המתאימה לבעלי חיים

1. צביעת חיידקים עם FISH (היברידיזציה פלואורסצנטית במקום)
   1. השתמשו בחוסם נוזלים או בעט PAP (עט מחסום הידרופובי) כדי להגביל את שטח התפשטות הנוזל על ידי סיבוב סביב אזור כל חתך רקמה. ודא שהדיו לא בא במגע עם החלק עצמו. צור עיגול קרוב ככל האפשר לכל חתך רקמה מבלי לגעת ברקמה כדי למזער את שטח הפנים שצריך להיות מכוסה בתמיסת ההיברידיזציה.
   2. הכינו את תמיסת ההיברידיזציה: עבור כל 50 מיקרוליטר של תמיסת היברידיזציה מחוממת מראש, הוסף גלאי של 0.5 מיקרוגרם (למשל, 0.5 מיקרוליטר של 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר גלאי). פיפט את פתרון ההיברידיזציה על החתכים שעל הסלייד (~20 מיקרוליטר למקטע, תלוי בגודל החתך/מעגל). להגן על תמיסת ההיברידיזציה ועל השקופות מפני אור מנקודה זו ואילך במהלך שלבי הדגירה והאחסון.
   3. ודא שנפח הנוזל שנעשה בו שימוש מכסה את כל החלק לאחר שכבת כיסוי פלסטיק גמישה. דגרו את המחסנית בתא לח כדי להפחית את האידוי. צרו תא לח עם קופסת קצה פיפטה עם מגבונים או מגבות נייר בתחתית שהושרו בתמיסת היברידיזציה עודפת או במי מלח עם בופר פוספט (PBS) כדי לספק לחות. דגרו את החתכים בטמפרטורה של 45-50 מעלות צלזיוס, בהתאם למערכת החישוש, למשך >3 שעות.
   4. חימום בופר השטיפה של FISH: 20 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4; 0.9 מטר NaCl עד 50 °C במהלך תקופת הדגירה. הכינו מספיק בופר כביסה כדי לכסות את השקופיות בצנצנת קופלין.
   5. להסיר את כיסויי הפלסטיק; הניחו את הסליידס בבופר הכביסה של FISH בצנצנת קופלין, שתיהן מחוממות מראש ל-50°C. החזירו את הצנצנת קופלין לתנור של 50°C למשך 10-20 דקות. לדגימות עבות, הסר את הכיסוי מצנצנת קופלין על ידי הוספת הבופר והסרקה עדינה של הכיסוי כדי למנוע מריחות הפרוסה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צנצנת קופלין	פישר	08-813E
זכוכית כיסוי, 22 × 22 מ"מ, אין #1	VWR	CA48366-227-1
DAPI	סיגמא-אלדריץ'	D9542	הושעה מחדש ל-5 מ"ג/מ"ל
קופסת קצה פיפטה ריקה			להמיס פרפין
גשושי FISH
פתרון היברידיזציה FISH	--	--	20 מ״מ טריס–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.01% (ללא גודל) SDS במים נטולי נוקלאז. הוספת פורמיד 5–50% (v/v) אופציונלית
בופר שטיפת דגים	--	--	20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl
לקטין ULEX Europaeus Agglutinin (UEA-1) מסומן פלואורסצנטי	מעבדות וקטור	FL-1061 (מסומן פלואורסאין) או RL-1062-2 (מסומן ברודמין)	UEA-1 מסמן גליקנים עם פוקוזילטים, ולכן אינו מתאים לעכברים חופשיים מחיידקים או לדגימות ממארחים חסרי פוקוזילטרנספראז 2 (FUT2).
מלקחיים
כיסויי פלסטיק גמישים של HybriSlip, 22 x 22 מ"מ × 0.25 מ"מ	סיגמא אולדריץ'	GBL722222	בשלבי הכלאה של FISH, ניתן להחליף כיסויי זכוכית
עט מחסום מים הידרופובי של ImmEdge	מעבדות וקטור	H-4000
קימווייפס
מיכלי אחסון דגימות רב-תכליתיים, 473 מ"ל	פישר	14-955-117A	אפשר להחליף במיכל זכוכית או פוליאתילן לבחירתך. מתקרן אינו תואם לפוליסטירן או למתכת.
לק לציפורניים	מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים	72180	כל לק לציפורניים אמור להתאים
תנור			טווח נדרש: 45-60 מעלות צלזיוס
PBS, תמיסת מלח עם בופר זרחן (תמיסה של 10x)	פישר	BP3991	לדלל ל-1x לפרוטוקול
כלוריד נתרן	פישר	S271
תמיסת טריזמה הידרוכלוריד, 1M טריס-HCl, pH 7.4	סיגמא-אלדריץ'	T2663-1L
מים, ללא נוקלאז	פישר	BP2484100