בידוד מבוסס אולטרה-צנטריפוגציה של וזיקולות ממברנה חיצונית של Legionella pneumophila

תקציר

מקור: יונג, א. ל. ואחרים. וזיקולות ממברנה חיצונית של Legionella pneumophila: בידוד וניתוח הפוטנציאל הפרו-דלקתי שלהן על מקרופאגים. J. Vis. Exp. (2017)

הסרטון הזה מדגים את הבידוד של וזיקולות ממברנה חיצונית (OMVs) מ-Legionella pneumophila באמצעות צנטריפוגציה סדרתית, סינון סטרילי ואולטרה-צנטריפוגה. ה-OMVs המטוהרים, המועשרים בחלבוני ממברנה וליפופוליסכרידים, מתאימים למחקרי אינטראקציה בין מארח לפתוגן.

פרוטוקול

1. טיפוח Legionella pneumophila

1. מרחו את זן L. pneumophila Corby (סוג בר, WT) על פלטות אגר של תמצית שמרי פחם עם בופר (BCYE) ודגרו אותן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים. הסנן 10 מ"ל של מרק תמצית שמרים (YEB) ב-OD₆₀₀ של 0.3 עם L. pneumophila מלוח הקדם-תרבות; דגרו את החיידקים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על שייקר מסתובב (150 סל"ד) למשך 6 שעות.
2. בדוק את טוהר התרבית הנוזלית על ידי פיזור 100 מיקרו-ליטר של התלייה על פלטת אגר דם. דגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
3. הוסף את תרבית הנוזל שנותרה ל-90 מ"ל מדיום YEB טרי ודוגר על שייקר מסתובב (37°C ו-150 סל"ד) כדי להגיע_{ל-OD 600} של 3.0-3.5, שלוקח כ-16-20 שעות.

2. הכנה וכימות של וזיקולות ממברנה חיצונית (OMVs) של L. pneumophila

הערה: בצע את כל שלבי הצנטריפוגה הבאים בתנאים סטריליים ובטמפרטורה של 4°C.

1. צנטריפוגה את תרבית הנוזל ב-4,000 x גרם למשך 20 דקות כדי לפרוק את החיידקים. העבר את הסופרנטנט לצינורות צנטריפוגה טריים, השליך את הכדור החיידקי, וחזור על הצנטריפוגה (4,000 x גרם למשך 20 דקות). חזור על השלב הזה פעם אחת.
2. מסנן סטרילי את הסופרנטנט שנותר פעמיים (גודל נקבוביות: 0.22 מיקרון). העבר את הסופרנטנט הנטול חיידקים לצינורות אולטרה-צנטריפוגה ואולטרה-צנטריפוגה בעוצמה של 100,000 x גרם למשך 3 שעות.
3. דרק את הסופרנטנט וזרוק אותו. החזירו את כדור ה-OMV לסליין סטרילי עם מאגר פספט (PBS) ואולטרה-צנטריפוגה (100,000 x גרם ל-3 שעות) כדי להסיר חלבונים ו-LPS מזהמים.
4. השליכו את הסופרנטנט והחזירו את כדור ה-OMV ל-500 מיקרו-ליטר של PBS סטרילי. רצף של 20 מיקרוליטר על פלטת אגר דם ועל פלטת אגר BCYE כדי למנוע זיהום חיידקי של הווציקולות המוכנות. דגרו את צלחת האגר בדם למשך הלילה ואת צלחת האגר BCYE למשך 3 ימים (שניהם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס).
   הערה: הריכוז של 100 מ"ל של תרבית L. pneumophila הוא בדרך כלל 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר. יש לאחסן את ה-OMV המוכנים והכמותיים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת פטרי 10 ס"מ	Sarstedt AG & Co KG (נומברכט, גרמניה)	82.1473
רוטור 70 Ti	חברת בקמן קולטר (קליפורניה, ארה"ב)	337922
קובטות	Sarstedt AG & Co KG (נומברכט, גרמניה)	67.742
חממת ה-CO₂ של Heracell 240i	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (בראונשווייג, גרמניה)	40830469
הראוס מולטיפוג' X3R	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (בראונשווייג, גרמניה)	75004515
לולאת חיסון	Sarstedt AG & Co KG (נומברכט, גרמניה)	86.1567.010
L. pneumophila קורבי	---	---
PBS	Biochrom GmbH (ברלין, גרמניה)	L 1825
שייקר מסתובב (MaxQ 6000)	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (בראונשווייג, גרמניה)	SHKE6000
אולטרוספק 10	ביוכרום בע"מ (קיימברידג', אנגליה)	80-2116-30
מסנן סטרילי (גודל נקבוביות: 0.22 מיקרון)	קורנינג אינקורפורייטד (ניו יורק, ארה"ב)	431096
פחם פעיל	Carl Roth GmbH & Co KG (קרלסרוהה, גרמניה)	X865.2
אגר-אגר, קובה הראשון	Carl Roth GmbH & Co KG (קרלסרוהה, גרמניה)	5210.2
אגר קולומביה עם 5% דם כבש	Becton Dickinson GmbH (היידלברג, גרמניה)	254005
תמצית שמרים	Carl Roth GmbH & Co KG (קרלסרוהה, גרמניה)	2363.2