בידוד וגידול חיידקים קשורים ל-Caenorhabditis elegans

תקציר

מקור: פטרסן, ק. ואחרים, בידוד ואפיון המיקרוביום הטבעי של הנמטודה המודל Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים את הבידוד והטיפוח של מיני חיידקים הקשורים ל-Caenorhabditis elegans. פירוק מבוסס חרוזים של C. elegans, ואחריו גידול סלקטיבי, מאפשר בידוד של זנים מיקרוביאליים מגוונים לניתוח נוסף.

פרוטוקול

1. בידוד וגידול חיידקים הקשורים לנמטודות (איור 1)

1. כדי לבודד חיידקים, יש להכין לוח עם 96 בארות עם שלושה חרוזים סטריליים בקוטר 1 מ"מ, 20 מיקרוליטר של בופר M9 בינוניים מינימליים (M9) לכל באר, והפיפטה של נמטודה בודדת שטופה לכל באר, תוך העברת כמה שפחות נוזלים.
   הערה: חלופה נוספת היא שטיפת אוכלוסיות תולעים מהלוחות באמצעות בופר M9, וניתן להעביר ~300 מיקרוליטר של בופר M9 המכיל תולעים לצינורות של 2 מ"ל עם 10-15 חרוזים.
2. שברו את הנמטודות באמצעות הומוגניזר חרוזים (למשל, הכבת חרוזים למשך 3 דקות ב-30 הרץ). צנטריפוגה את הפלטה או הצינורות לזמן קצר כדי להעביר את הנוזל לתחתית (למשל, למשך 10 שניות בטמפרטורה של 8000 x g בטמפרטורת החדר, RT).
   הערה: השימוש בשיטה זו הוביל לבידוד טקסונים חיידקיים הדומים לאלו שנחשפו בריצוף אמפליקונים של 16S ריבוזום DNA (rDNA), מה שמרמז כי הקצאת החרוזים המתוארת משאירת את רוב תאי החיידקים שלמים.
3. אסוף את הסופרנאנט, מדלל אותו בסדרה ב-1:10, וצלח עד 100 מיקרוליטר על לוחות אגר בקוטר 9 ס"מ.
   1. כדי להבטיח שרוב החיידקים יוכלו לגדל, יש להשתמש במגוון מדיום חלופי עם הרכבים מזינים שונים, כולל אגר טריפטיקאז סויה מדולל (TSA, דילול 1:10), אגר מקונקי, אגר גלוקוז סבורו, אגר דקסטרוז תפוחי אדמה, או אגר פטון דקסטרוז שמרים.
4. דגרו את הלוחות בתנאי טמפרטורה ממוצעים של מיקום הדגימה (למשל, טמפרטורות בין 15-20 מעלות צלזיוס לאזורים ממוזגים) למשך 24-48 שעות.
5. השתמשו בטכניקת שלוש הפסים הסטנדרטית ובלולאת סטרילית לקבלת תרביות חיידקים טהורות (איור 1).
   1. קטף מושבה אחת מתוך צלחת באמצעות לולאה סטרילית או קיסם ומרח אותה על פלטת אגר חדשה המכילה את אותו מדיום אגר כמו לטיהור. תוודא שאתה משתמש רק בכשליש מהצלחת.
   2. או שתשתמש בלולאה סטרילית חדשה או תעקר לולאה רב-פעמית ותגרור אותה דרך הרצף הראשון כדי ליצור רצף שני על שליש נוסף של אותה פלטה.
   3. חזור על שלב זה על ידי גרירת לולאה סטרילית דרך הרצף השני.
   4. דגור את הפלטה באותם תנאי גדילה המשמשים לבידוד. טכניקה זו חייבת לגרום למושבות בודדות לצמוח באזור הרצף השלישי.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך לחזור על שלב הטיהור מספר פעמים, שכן מבודדים טבעיים נוטים ליצור ביופילמים ו/או אגרגטים.
6. גדלו את המושבות הטהורות במדיום נוזלי (מאותו סוג כמו מדיום האגר) באותה טמפרטורה וזמן גדילה כמו לעיל (שלב 1.4)

תוצאות

איור 1: זיהוי ובידוד מינים של חיידקים בודדים. נמטודות בודדות מפורקות באמצעות הומוגניזר חרוזים, וה-DNA מבודד לזיהוי מין באמצעות PCR או ריצוף. לחילופין, חומר הנמטודה השבור מדולל באופן סדרתי ומצופה על פלטות מדיום גדילה. לוחות מדוגרים עד שמופיעות מוש...