$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים המוסדית המקומית וועדת הביקורת הווטרינרית של JoVE.
1. בידוד קהילת חיידקים תוך-תאית (IBC): פיפטינג בפה של IBCs
הערה: כל השיטות המתוארות בסעיף זה עברו הערכת סיכון מוסדית. פיפטינג בפה נושא את הסיכון הטמון בבליעת התמיסה המועברת. סיכון זה מתמתן במידה רבה בזכות נפחי הננוליטר שבהם משתמש הפרוטוקול הזה, ואנו ממליצים לכל משתמשי הפרוטוקול לשים לב לאמצעי הזהירות ולהערות התרגול המפורטות כאן ובדיון.
- לאחר שהתאים נגרדו לתוך ה-PBS (סליין עם בופר זרחן), הקמנו את מכשיר המיקרופיפטינג בפה (איור 1C).
- הכנס את הקצה העבה של נימי הזכוכית המשוכה (הקצה הלא נמשוך) לתוך פקק הגומי (הקצה הלבן) של צינור השאיבר.
- הכנס את הקצה הצר של קצה פיפטה בנפח 1 מ"ל לקצה הפתוח השני (אדום) של צינור השאיבר, כדי להבטיח התאמה צמודה.
- הכנס את הקצה הצר של פיפטה שאיבת 2 מ"ל לקצה הפתוח והרחב של קצה הפיפטה בנפח 1 מ"ל, שוב להבטיח התאמה הדוקה שוב.
הערה: ההתקנה שנוצרת מאפשרת לחוקר לשחרר פיפטה מהקצה הרחב והפתוח של הפיפטה השאיפה, כדי ליצור כוח יניקה עדין מהקצה הצר של הצינור הקפילרי בקצה השני של המכשיר. - בדקו את מכשיר המיקרופיפטינג הסופי בפה באמצעות צלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ המכילה מים טריים ללא יוניים. פעולה קלה של יניקה בקצה הפתוח של הפיפטה השואפת (בדומה לשתייה דרך קשית) אמורה להעלות את רמת הנוזל בקפילריה, אך לא לגרום למים המופרזים לגלוש אל צינור השאיבה. השתמשו ביד אחת לשליטה בצינור הנימים, וביד השנייה לכיוון מיקום צלחת הפטרי.
הערה: עוצמת היניקה הנדרשת לפיפטינג בפה של IBC יחיד תשתנה בין החוקרים. עם זאת, מומלץ לכל חוקר שמנסה טכניקה זו להתחיל ביניקה חלשה ולהגביר אותה בהדרגה אם אין נוזל שזורם במעלה הנימים. אין צורך בכוח גדול יותר מלמצוץ קשית בשביל שתייה. אם הנימים לא נראים קולטים נוזלים במהלך הבדיקה בשלב 1.1.4, ייתכן שהנימים או צינור השאיפה חסומים ויש להחליפם. מומלץ גם שכל החוקרים החדשים יתרגלו תחילה שליטה ביניקה במכשיר פיפטינג בפה באמצעות מים מעוקרים. בנוסף, יש לשים לב כי השליטה בנפח הנתפס על ידי מכשיר הפיפטה בפה מתבצעת באמצעות לשון החוקר. הלשון יכולה לכוון בעדינות את עוצמת היניקה המופעלת, וכן לשמש כעצירה חירומית. - לאחר השגת ספיגת נוזל מוצלחת, בדוק את היכולת להוציא אותו מהנימים על ידי נשיפה עדינה לקצה הפתוח של הפיפטה השואפת. ודאו שלא נוצרו בועות בתהליך פליטת הנוזל כדי למנוע זיהום של ה-IBC במהלך שלב 1.5.
הערה: כמו בשאיבה, עוצמת הלחץ החיובי שמפעיל החוקר כדי להוציא את ה-IBC לצינור הצנטריפוגה תשתנה בין החוקרים. מומלץ לחוקרים החדשים לפרוטוקול זה לתרגל את שלב 1.1 כמה ימים לפני ההדבקה בפועל. הצעה אחת לתרגול מיקרופיפטינג בפה היא לתרגל העברת כמויות קטנות של מים מעוקרים מעורבבים עם כמה טיפות צבע מזון (לצורך נראות) באמצעות מכשיר המיקרופיפטות בפה.
- הניחו את תליית התא השרוט תחת מיקרוסקופ הניתוח וזהו את ה-IBCs כאגרגטים פלואורסצנטיים גדולים (איור 1A, B). טווח ההגדלה האידיאלי הוא 20-40x. טבלו את הקצה הדק של נימי הזכוכית בצינור PBS חדש למשך שנייה כדי להפחית את קליטת הנפח הלא רצוי דרך פעולה קפילרית.
- בהסתכלות דרך המיקרוסקופ, מזהים את ה-IBC המעניין והביאו לאט לאט את הקצה הפתוח של צינור הנימים לכיוון ה-IBC. השתמש בקצה הדק של נימי הזכוכית כדי לסלק תאים נוספים ליד כל IBC כדי למנוע שאיפת שני תאים או יותר, או לפרק קבוצות תאים גדולות יותר.
- בעת הסתכלות דרך המיקרוסקופ, יש להפעיל כוח יניקה קטן מאוד על הקצה הרחוק (פיפטה שואפת) של מכשיר המיקרופיפטינג בפה כדי להנחות את ה-IBC אל תוך הקפילריה הזכוכיתית.
- לאחר איסוף ה-IBC, העבר את הנימים לצינור צנטריפוגה ריק בנפח 1.5 מ"ל והפעל לחץ חיובי קל כדי להוציא את הטיפה ואת ה-IBC לצינור הצנטריפוגה (איור 1D).
- חזור על שלבים 1.3-1.6 ככל שנדרשים מספר IBCs מהשלפוחית הנוכחית, לפני שממשיכים לשלפוחית הבאה. החליפו לעיתים קרובות פיפטות ואיש שאיבה כדי למנוע הצטברות רוק.
אזהרה: כאשר עובדים עם זנים זיהומיים (או קליניים) של חיידקים, יש לעקוב כל הזמן אחרי רמת התמיסה בנימים. אל תתנו לרמת הנוזל המוזרם לעלות על גבול מקצה הנימים אל צינור השאיבה. אם זה קורה, עברו מיד לצינור שאיפה אחר, וזרקו את ההתקנה הקודמת. - חזור על שלבים 1.2-1.6 בכל השלפוחית שנקטפה, או עד שנאסף מספיק דגימות ביולוגיות עבור קבוצת הניסוי.
- (אופציונלי) חזור על השלבים 1.6 ו-1.7 עד שכל קבוצות הניסוי (או העכברים) יושמדו ויילקחו מספיק דגימות ביולוגיות מכל קבוצה.
