זיהוי ביטוי גן מטרה במוח עכבר נגוע בחיידקים

תקציר

מקור: ז'אנג, ס. ואחרים. מסלול זיהום תוך-גולגולתי סוברכנואידלי לחקירת תפקידי ביופילמים של סטרפטוקוקוס סואיס בדלקת קרום המוח במודל זיהום עכבר. J. Vis. Exp. (2018).

הסרטון הזה מדגים את גילוי ביטוי גן המטרה במוח עכבר נגוע בחיידקים. ה-RNA מופק, מטופל באנזים מפרק DNA, ומועתק לאחור ל-cDNA. ה-cDNA מוגבר באמצעות מחזור תרמי עם פריימרים ייחודיים לגנים, בעוד שצבע קושר DNA נקשר ל-DNA המוגבר ופולט פלואורסצנציה. אותות הפלואורסצנציה מנותחים כדי לאשר את נוכחות הגן היעד.

פרוטוקול

1. הכנת חיידקים

הערה: זן אלים מסוג Srotype 2 מסוג Streptococcus suis (S. suis) בודד מחזיר חולה עם דלקת קרום המוח. הזן P1/7 גודל במרק טוד-היואיט (THB, נוסחה לליטר THB: עירוי לב, 3.1 גרם; ניאופפטון, 20.0 גרם; דקסטרוז, 2.0 גרם; כלוריד נתרן, 2.0 גרם; פוספט דינתרן, 0.4 גרם; פחמת נתרן, 2.5 גרם) וצופה על אגר טוד-היואיט (THA, נוסחה לליטר של THA: הזרקת לב, 3.1 גרם; ניאופפטון, 20.0 גרם; דקסטרוז, 2.0 גרם; נתרן כלורי, 2.0 גרם; פוספט דינתריום, 0.4 גרם; פחמת נתרן, 2.5 גרם; אגר, 15.0 גרם) בטמפרטורה של 37°C ו-5%_CO2.

1. אוסף תאי פלנקטוניים בזן P1/7
   1. לאסוף 5 מ"ל של תאי פלנקטוניים מתרבות פאזה באמצע הלוגריתם (OD₆₀₀=0.6), צנטריפוגה למשך 3 דקות ב-8000 × גרם, ואז שטוף 3 פעמים עם מלח מפופר פוספט (PBS).
   2. החזירו את התאים עם 5 מ"ל של 25% גליצרול ב-THB, מחברים ל-5 צינורות, ואז אחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
2. אוסף תאי מצב ביופילם בזן P1/7
   1. קח 20 מ"ל תרבית לילה והוסיף ל-180 מ"ל THB טרי; חלק את התרבית המדוללת שווה בשווה ל-10 לוחות תרביות עגולים, ואז הניחו את הלוחות באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ב-5%_CO2 למשך 24 שעות.
   2. לאחר הדגירה, נערו בעדינות את הצלחת כדי להחזיר את החיידקים שלא נדבקו לפלטה, ואז זרקו את הסופרנטנט באמצעות שאיבה.
      הערה: נערו את הצלחת בעדינות והימנעו מהחזרת המשקע.
   3. הוסיפו 5 מ"ל PBS כדי לקצור תאי מצב ביופילם, החזירו את המשקעים למצב מלא, ואז העבירו את הדגימה לצינור חדש.
   4. סוניקציה של תאי מצב הביופילם מהשלב האחרון עם הפרמטרים הבאים: 60 וואט, 4 מחזורים, 5 שניות דלוק ו-10 שניות כבוי.
   5. צנטריפוגה ל-3 דקות ב-8000 × גרם ואחסן את הסופרנטנט ב-80 מעלות צלזיוס.
      הערה: הסופרנטנט עשוי להכיל רכיבי ביופילם, וניתן להשתמש בו להשעיית חיידקי הביופילם לפני הזיהום כפי שמתואר בניסויים בבעלי חיים (שלב 2).
   6. החזירו את המשקע עם 10 מ"ל גליצרול 25% ב-THB ואז אחסנו את תאי מצב הביופילם בטמפרטורה של -80°C.

2. ניסויים בבעלי חיים

1. במחקר זה השתמשו בעכברים BALB/c נקבות בנות 6 שבועות עם SPF. הדביקו את כל העכברים דרך מסלול הזיהום התוך-גולגולתי התת-עכבישי, שאתר ההזרקה ממוקם 3.5 מ"מ רוסטרל מהברגמה.
   1. לצורך ניתוח היסטופתולוגי, הדביקו שתי קבוצות עכברים (5 עכברים בכל קבוצה) באמצעות תאי פלנקטוניים או תאי מצב ביופילם במינון של 3 ×-10⁷ יחידות יוצרות מושבות (CFU), ועוד 5 עכברים הוזרקו PBS כאמצעי ביקורת.
   2. לצורך זיהוי ביטוי mRNA של TLR2 וציטוקינים במוח, יש להדביק שתי קבוצות נוספות של עכברים (6 עכברים בכל קבוצה) באמצעות תאי פלנקטוניים או תאי מצב ביופילם במינון של 3 × 10⁷ CFU.
   3. קבעו את מספר החיידקים החיים על ידי ציפוי דילול סדרתי על THA.
   4. הורד את כל העכברים 12 שעות לאחר ההדבקה למחקר נוסף. ​
      הערה: יש להסיר את הגליצרול מהמדיום המקורי לפני ההדבקה. גם תאי פלנקטוניים וגם תאי מצב ביופילם שנאספו מ-80 מעלות צלזיוס נשטפים שלוש פעמים באמצעות PBS. לאחר מכן, תאי פלנקטוניים מושלים מחדש עם PBS ומדוללים למינון המתאים לזיהום; תאי מצב ביופילם מוחזקים מחדש עם הסופרנטנט המאוחסן (משלב 1.2.5) ומדוללים למינון המתאים לזיהום. הנפח לזיהום לא צריך לעלות על 50 מיקרוליטר.
2. זיהוי ביטוי mRNA של TLR2 וציטוקינים ברקמת המוח
   1. להוציא את כל ה-RNA מרקמת המוח באמצעות ערכת חילוץ RNA.
      1. לכל עכבר, השתמשו בכל רקמת המוח להפקת RNA. חלק את כל רקמת המוח ל-5 צינורות. קחו עד 100 מ"ג רקמת מוח והוסיפו 1 מ"ל תמיסת ליזיס לכל צינור המכיל את מטריצת הליזינג שמספקת הערכה.
      2. מעבד את הצינור בהומוגניזר במשך 40 שניות בהגדרה של 6.0, ואז צנטריפוגה את הצינור ב-12000 × גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
      3. לאחר הצנטריפוגה, העבר את הפאזה העליונה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.
      4. דגרו את הדגימה המועברת למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר; מוסיפים 300 מיקרוליטר כלורופורם, מערבולת במשך 10 שניות, ואז דגרו 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      5. צנטריפוגה את הצינור ב-12000 × גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. העבר את הפאזה העליונה לצינור חדש.
      6. הוסיפו 500 מיקרוליטר אתנול קר אבסולוטי לצינור לפני הפיכתו 5 פעמים, ואז אחסנו את הדגימה בטמפרטורה של מינוס 20°C למשך לפחות שעה.
      7. צנטריפוגה את הצינור ב-12000 × גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות והסר את הסופרנטנט. שטוף את הכדור ב-500 מיקרוליטר של אתנול קר עם 75% במים ללא RNase (_H2O).
      8. הסר את האתנול, ייבש את הכדור באוויר במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, והחזיר את ה-RNA ל-100 מיקרוליטר_H2O ללא RNase.
      9. דגרו את ה-RNA למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר וקבעו את ריכוז ה-RNA באמצעות אנלייזר RNA.
   2. לבצע סינתזת DNA משלים (cDNA), כולל הסרת DNA גנומי (gDNA), באמצעות תרמחזור עם ערכת תגובת שעתוק הפוך (RT).
      1. הוסף 1 מיקרוגרם RNA לצינור המכיל 2 מיקרוליטר של 5x בופר לחיסול gDNA, 1 מיקרוליטר של אנזים הסרת gDNA,_ו-H2O ללא RNase עד שנפח מגיע ל-10 מיקרוליטר. יש לדוגר למשך 2 דקות בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס.
      2. מוסיפים 10 מיקרוליטר של תערובת מאסטר (1 מיקרוליטר של RT Mix I, 1 מיקרוליטר של RT פריימר Mix, 4 מיקרוליטר של 5x Buffer 2, ו-4 מיקרוליטר_H2O ללא RNase) לתמיסת התגובה מהשלב האחרון ואז מערבבים בעדינות. המשך מיד עם תגובת RT: 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ואז 85 מעלות צלזיוס ל-5 שניות.
      3. בצע את ניתוח תגובת שרשרת הפולימראז הכמותית בזמן אמת (RT-qPCR) באמצעות מכונת PCR בזמן אמת עם ערכת SYBR RT-qPCR. מוסיפים 10 מיקרוליטר של אנזים 2x, 0.8 מיקרוליטר פריימר קדמי, 0.8 מיקרוליטר פריימר הפוך, 0.4 מיקרוליטר של 50x ROX Reference Dye II, 2 מיקרוליטר של תבנית cDNA, ו-H2 O ללאRNase עד לנפח כולל של 20 מיקרוליטר.
      4. הרץ כל דגימה בשלוש עותקים לפי הפרמטרים התרמיים הבאים: 30 שניות ב-94 מעלות צלזיוס, אחריהם 40 מחזורים של 5 שניות ב-95 מעלות צלזיוס, ו-34 שניות ב-60 מעלות צלזיוס, עם שלב סופי של 15 שניות ב-95 מעלות צלזיוס, דקה אחת ב-60 מעלות צלזיוס, ו-15 שניות ב-95 מעלות צלזיוס. פריימרים ל-RT-qPCR מפורטים בטבלה 1. גנים לניקיון B2m ו-18s rRNA שימשו כבקרה פנימית.
   3. חשב את שינוי הקיפול היחסי בהתבסס על שיטת ^2-ΔΔCt .

טבלה 1: פריימרים ל-RT-qPCR.

שם ראשי	רצף (5'-3')	סמל גן
חלוץ IL-6	CTTCCATCCAGTTGCCTTCTCT	Il6
הפוך IL-6	CTCCGACTTGTGAAGTGTGTTAGTAG	Il6
TLR2 קדימה	CACTATCCGGGGTTGCATATC	TLR2
הפוך TLR2	GGAAGACCTTGCTGTTCTCTTAC	TLR2
CCL2 קדימה	CTCACCTGCTGCTACTCATTC	Ccl2
רוורס CCL2	ACTACAGCTTTTTTGGGACAC	Ccl2
TNF-α קדימה	TTGTCTACTCCCAGGTTCTCT	Tnf
הפוך TNF-α	GAGGTTGACTCTCCTGGTATG	Tnf
β2 מטר קדימה	GGTCTCTGTGTGCTTGTCTCT	B2m
הפוך β2m	TATGTCGGCTTCCCATTCTC	B2m
18 דקות קדימה	GTAACCCGTTGAACCCCATT	rRNA בן 18
רוברס של 18 שניות	CCATCCAATCGGTAGTAGCG	rRNA בן 18

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מרק טוד יואיט (THB)	בקטון, דיקינסון ושות'	DF0492078	המיס 30 גרם מהאבקה ב-1 ליטר מים מזוהרים. אוטוקלאב ב-121° למשך 15 דקות.
אגר	DSBIO	16C0050	ממיסים 15 גרם מהאבקה ב-1 ליטר THB. אוטוקלאב ב-121° למשך 15 דקות.
מערכת טיהור מים ייחוס Milli-Q	מרק KGaA	Z00QSVCUS	בלי Dnase/Rnase
NaCl	טיאנג'ין קמיו ריג'נט כימיקלים בע"מ	10019318
Na₂HPO₄	חברת שילונג מדעית בע"מ	9009012-01-09
KCl	חברת שילונג מדעית בע"מ	9009017-01-09
KH₂PO₄	חברת שילונג מדעית בע"מ	9009019-01-09
KOH	חברת שילונג מדעית בע"מ	9009014-01-09
גליצרול	סיונפארם חומר כימי ריג'נט בע"מ	10010618	מדולל בנפח שווה של מים מטוהרים, אוטוקלאב בטמפרטורה של 121° למשך 15 דקות
4% פאראפורמלדהיד	סיונפארם חומר כימי ריג'נט בע"מ	80096675
25% גלוטראלדהיד	סיונפארם חומר כימי ריג'נט בע"מ	30092436	10-fold מדולל במים מטוהרים לקיבוע.
אתנול	סיונפארם חומר כימי ריג'נט בע"מ	10009218
כלורופורם	סיונפארם חומר כימי ריג'נט בע"מ	10006818
ספטרופוטומטר	DeNovix Inc.	DS-11+
מפצח תאי אולטרסאונד	נינגבו סיינטז ביוטכנולוגיה בע"מ	JY96-IIN
צנטריפוגה	היטאצ'י קוקי בע"מ	CT15RE
מקרר	Aucma Co., Ltd	DW-86L500
ערכת FastRNA Pro Green	ביומדיקל MP	#6045-050
כלי FastPrep-24	ביומדיקל MP	116005500
מכשיר ל-PCR	SensoQuest GmbH	1124310110
QuantStudio 6 Flex	תרמו פישר סיינטיפיק	4485689
SYBR Premix Ex Taq II	חברת Takara Biomedical Technology (בייג'ינג) בע"מ	RR820A
ערכת ריאגנט RT של PrimeScript עם מחק gDNA	חברת Takara Biomedical Technology (בייג'ינג) בע"מ	RR047A