העברת מיקרובקטריום טוברקולוזיס באירוסול לזיהום ריאתי במודל עכבר

תקציר

מקור: מולר, א., ואחרים. מודל ניסויי לחקר זיהום משותף בין שחפת למלריה לאחר העברה טבעית של מיקובקטריום טוברקולוזיס ופלסמודיום ברגהי. J. Vis. Exp. (2014)

הסרטון הזה מדגים את העברת האירוסולים של מיקובקטריום טוברקולוזיס (Mtb) לעכברים באמצעות מערכת תא מבוססת נבולייזר לגרימת זיהום ריאתי, ומספק מודל מבוקר וניתן לשחזור לחקר העברת שחפת באוויר ואינטראקציות בין מארח-פתוגן בגוף.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים המוסדית המקומית וועדת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. זיהום אירוסולים בעכברים עם Mtb באמצעות תא אירוסול Glas-Col

הדרך הטובה ביותר לסטנדרטיזציה של זיהום אירוסולים בבעלי חיים ניסיוניים עם Mtb (מיקובקטריום טוברקולוזיס) היא להשתמש במיקובקטריות ממאגרים קפואים עם טיטרים ידועים של CFU (יחידות יוצרות מושבה). להכנת תרביות מלאי, ננקטים במקביל גידול Mtb במרק מידלברוק 7H9 בתוספת מדיום העשרה OADC (חומצה אולאית, אלבומין, דקסטרוז, קטלאז) ו-0.05% Tween 80, מקור פחמן למיקובקטריה, וכן אמצעים למניעת הצטברות חיידקים. לתרביות צריך להיות OD (צפיפות אופטית) ≤ 1 בזמן הקציר. ברמות יתר גבוהות, הצטברות חיידקים עולה והחיוניות יורדת. אחסן 1 מ"ל אליקוות בטמפרטורה של -80°C. קבע את מספר ה-CFU הבריטי במלאי קפוא על ידי ציפוי סדרת דילול פי 10 של שלושה מבחנות עצמאיות על פלטות אגר 7H11 עם תוספת של 0.5% גליצרול, 1 גרם לליטר אספרגין ו-OADC ומניית מושבות לאחר 4 שבועות של דגירה ב-37 מעלות צלזיוס. לבצע זיהום באירוסול כפי שמתואר להלן.

1. הפשרו את מלאי ה-Mtb של טיטר CFU ידוע וערבבו בזהירות את המתלה חמש פעמים כדי לפזר גושי חיידקים באמצעות מזרק של 1 מ"ל המצויד במחט 27 גרון. הימנעו מייצור אירוסולים.
2. בהתאם למינון הזיהום הרצוי, העבר את הנפח הנדרש של המאגר המיקרובקטריאלי לצינור של 50 מ"ל המכיל מי מלח סטריליים עם בופר פוספט (PBS). הכרך הסופי הוא 6 מ"ל.

הערה: על ידי שינוי מספר המיקרואורגניזמים במתלה זה, משתנה שיעור החיידקים הנושאים טיפות תרסיס. בדרך כלל אנו שואפים לספיגה של 100 חיידקים בריאים בכל ריאה (זיהום במינון נמוך). מניסיוננו, זה דורש כ-1-2 ×^{10 6} Mtb/ml בנפח כולל של 6 מ"ל, מתוכם 5.5 מ"ל הם נבובלייזציה. מומלץ לבצע סדרת אתגרי אירוסול ניסיוניים עם ריכוזים שונים של חיידקים כדי למצוא את התנאים האידיאליים לזיהום שלך. בעוד שניתן לבצע זיהומים במינון גבוה עם עד 5,000 מיקובקטריים כדי להאיץ את תהליך ההדבקה, ניתן להשתמש ב-5 חיידקים בלבד כדי להדביק עכברים בהצלחה באמצעות אירוסול. שיעור ההדבקה בדרך כלל הוא 100%.

3. הסרת נפח מספיק (מוכן מעבר לנפח הסופי הנדרש) לציפוי כדי לקבוע את מדד האינוקולום; בדרך כלל אנחנו מסירים 500 מיקרו ליטר לציפוי משולשים טכניים.
4. הניחו בעלי חיים בסל רשת מחולק (עכבר אחד לכל סל) בתוך תא האירוסול העגול וסגרו את מכסה תא האירוסול.

הערה: דגמים אחרים מצוידים בסל בצורת פאי המורכב מחמישה תאים נפרדים, שכל אחד מהם יכול להכיל 20 עכברים.

5. חבר את יחידת הנבולייזר של Venturi לשלושת מפרקי השקע מנירוסטה.
6. הסר את ההשעיה המיקובקטריאלית מצינור ה-50 מ"ל עם מזרק 10 מ"ל המצויד במחט קהה של 18 גרם והעבר את המזרק לתא האירוסול בתיבת הובלה סגורה.
7. הסר את מכסה הברג של יחידת הנבולייזר והזריק בזהירות את תליית המיקובקטריקה לתוכו. הימנע מיצירת אירוסולים. זרוק את המזרק למיכל חדות שמכיל 2% בורטון. אטום את הנבולייזר עם פקק הברג.
8. הדליקו את מתג החשמל הראשי ואת מנורת ה-UV. התצוגה על לוח המקשים מראה "Glas-Col Apparatus Co".
9. הפעל את מתג התוכנית. התצוגה תראה "האם הנבולייזר מוכן?" "האם הסל טעון?" לחץ על Enter כשהוא מוכן". לחץ אנטר.
10. התצוגה מציגה "Enter Preheat Time 900"; משמעות הדבר היא שזמן החימום המוקדם של השריפה (שמנקה את אוויר הפליטה) הוא 900 שניות. לחץ אנטר.
11. התצוגה תציג "נכנס לזמן נבוליטינג 1,800"; זה אומר שזמן הניבוליזציה מוגדר ל-1,800 שניות כברירת מחדל. כדי להאריך את זמן הנבוליזציה, הזן "2,400" ולחץ אנטר.

הערה: במהלך מחזור הנבוליזציה, האוויר תחת לחץ מפרק את המתלוי, וכך יוצר טיפות אירוסול קטנות המכילות מיקובקטריה. עם זרימת האוויר הראשית, טיפות אלו (בגודל של כ-2-5 מיקרון) נישאות לתא האירוסול.

 

12. התצוגה תציג "Enter C.D. Time 1,800"; זה אומר שמחזור הדעיכה אורך 1,800 שניות. הגדר ל-"2,400" ולחץ אנטר.

הערה: במהלך מחזור זה, הענן שנבנה בתא האירוסול במהלך מחזור הנבוליזציה עלול להתפרק. הטיפות הקטנות נשאפות על ידי בעלי החיים הניסיוניים.

13. התצוגה תציג "הזנת זמן דצמבר 900"; זה אומר שמחזור ניקוי ה-UV ייקח 900 שניות. לחץ אנטר. המכונה תתחיל לעבור חימום מוקדם, נבוליזציה, דעיכת עננים וניקוי UV.
    אזהרה: מד זרימת הוואקום אמור להצביע על 60 רגל מעוקב לשעה (בדוק מתי מתחיל מחזור חימום מוקדם; כוון את שסתום בקרת הוואקום במידת הצורך) ואת מד זרימת האוויר הדחוס 10 רגל מעוקב לשעה (בדוק מתי מתחיל מחזור הנבוליזציה; כוון את שסתום בקרת האוויר בהתאם).
14. כאשר המחזור מסתיים, לוח המקשים יציג "התהליך הושלם – הסרת דגימה". כבה את התוכנית, ה-UV ואת מתג החשמל הראשי.
15. בדוק אם תליון המיקובקטריאלי עבר נבוליזציה מלאה ואם לא, רשמו את הנפח הנותר על ידי הסרת המתלה בזהירות עם מזרק מתאים המצויד במחט קהה של 18 גרם. הנפח הנותר לא צריך להיות יותר מ-1 מ"ל.
16. הסר את הנבולייזר מהמפרקים והניח אותו במחבת עם 2% בורטון למשך לפחות שעתיים, בדרך כלל החיטוי נעשה ב-O/N. לאחר מכן, העבר את הנבולייזר למחבת טרייה ושוטף היטב במים. תשאיר את הנבולייזר להתייבש באוויר.
17. פתח את תא האירוסול והחזר את בעלי החיים לכלובים שלהם. ארזו את הסלים בשקיות אוטוקלאב ובאוטוקלאב. נקה את פני השטח של תא האירוסול עם 2% בורטון.

הערה: מטעמי בטיחות, יש ללבוש מסכת טיהור אוויר חשמלית במהלך הליך זה.

18. באמצעות 500 מיקרולטר שנותרו של ההשעיה המיקובקטריאלית (ראו שלב 1.3), דילול פי 10 של פלטה של טריפלקט טכני (3 x 100 מיקרוליטר) על לוחות אגר 7H11.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
בורטון	שילקה		רכיבים פעילים: אלדהידים (פורמלדהיד, גלוטראלדהיד, אוקסלאלדהיד, אתיל הקסנל)
מידלברוק 7H9	סיגמא	M0178	לתרביות מרקי הר
מידלברוק 7H11	BD ביוסיינסס	283810	מדיום אגר לתרבות הר
מדיום העשרה של מידלברוק OADC	BD ביוסיינסס	212240	הוסיפו ל-7H9 ו-7H11 לתרבות Mtb
מערכת חשיפה לשאיפות	גלאס-קול
נבולייזר-ונטורי	גלאס-קול