הדמיית ביולומינסציה של זיהומים חיידקיים בעכברים

תקציר

מקור: דה וריס, ס. ר. ואח', מודל חיסון מאוחר של זיהום פצע כרוני בפסאודומונס אארוגינוסה . J. Vis. Exp. (2020).

הסרטון הזה מדגים טכניקת הדמיה ביולומינצנטית למעקב אחר התקדמות זיהום חיידקי במודל עכבר חי. חיידקים פתוגניים שהונדסו באמצעות מערכת הדיווח luxABCDE פולטים אור באתר הזיהום, ומאפשרים ויזואליזציה של חיידקים פעילים מטבולית. על ידי הדמיית העכבר לאורך זמן, החוקרים יכולים לעקוב באופן לא פולשני אחר דינמיקת הזיהומים ולכמת את עוצמת האות הביולומינצנטי.

פרוטוקול

1. הכנה וצמיחת חיידקים

1. יש לבצע את כל העבודה עם P. aeruginosa ובעלי חיים עם אמצעי זהירות BSL-2 בהתאם להנחיות ועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית של החוקר וועדת השימוש בבעלי חיים. בצע את כל השלבים המתוארים כאן בנוגע ל-P. aeruginosa, כולל חיסון עכברים, בארון בטיחות ביולוגית.
2. הזן הזוהר PAO1:lux של P. aeruginosa זמין במעבדתנו לפי בקשה. Streak PAO1, מאוחסן כמאגר גליצרול קפוא, על אגר Lysogeny Broth (LB). לזן הזוהר PAO1:lux, אגר LB צריך להכיל אנטיביוטיקה סלקטיבית (100 מיקרוגרם/מ"ל קרבניצילין ו-12.5 מיקרוגרם/מ"ל קאנמיצין). גדל בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה באינקובטור חיידקים.
3. בחר מושבה מבודדת וגדל לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשקל 3 מ"ל ליב, pH של 7.4. לזנים זוהרים, המרק צריך להכיל 100 מיקרוגרם/מ"ל קרבניצילין. גדל בתנאים רועדים ואירוביים.

2. הכנה לפרוצדורה

1. תבקש מכל הצוות לבצע ניתוח ללבוש חלוק/חלוק מעבדה נקי, מסכת פנים, רשת לשיער וכפפות.
2. אוטוקלב לכל כלי הניתוח, כולל מספריים ומלקחיים. השתמש בטכניקת אספטיקה כדי לחטא כלים בין בעלי חיים.
3. נקה את שולחן הניתוח באתנול והכין שדה ניתוח נקי.

3. הסרת שיער

1. הרדימו עכברים בני 8–12 שבועות עם C57BL/6J באמצעות 1%–3% איזופלורן. החוקרים צריכים לפעול לפי הנחיות הצוות הווטרינרי של המוסד שלהם להרדמה בעת שימוש באיזופלורן.
   1. התחל הרדמה על ידי מתן איזופלורן של 1%–3% וכיוון את קצב זרימת החמצן ל-1.5 ליטר לדקה. הנח את העכבר בתא ההשראה.
   2. צבוט את אצבע הרגל של העכבר כדי לבדוק את עומק ההרדמה. כאשר העכבר כבר לא מגיב לגירוי, יש להוציא אותו מתא האינדוקציה ולהניח אותו על שולחן הניתוח כשהאף נמצא בתוך חרוט האף האיזופלורן.
   3. מרחו חומר סיכה עיניים על שתי העיניים.
2. שקלו את העכבר כדי לקבל משקל בסיסי לפני ההליך.
3. הנח את העכבר בשכיבה. הזרקו לעכבר תת-עורית נתרן כלוריד 0.9% סטרילי מחומם מראש, 250 מיקרוליטר בכל צד, לסך כולל של 500 מיקרוליטר.
4. גלח את אזור הגב של העכבר באמצעות מכונת גילוח חשמלית. הגילוח צריך להתבצע במקום שונה מתחנת הניתוח כדי למנוע זיהום שיער בפצע.
5. מרחי שכבה דקה של קרם להסרת שיער. תן לקרם לעמוד ל-20–60 שניות. הסר את השיער והקרם העודף עם גזה רטובה במים חמים. לאחר הסרת השיער, יש לעבור את הליך הפציעה ההכרתית.

4. ניתוח פצע כריתה בעובי מלא

1. הזרקו בופרנורפין בשחרור מתמשך 0.6–1 מ"ג/ק"ג תת-עורית באמצעות מחט של 25 גרם באזור הגב האמצעי של העכבר. בופרנורפין בשחרור איטי מספק הקלה בכאבים במשך 48–72 שעות.
2. חטא את אתר הניתוח. נגב את המשטח הגבי עם מטוש בטדין סטרילי. נגב עודפי בטאדין עם מטוש אלכוהול סטרילי. יש לבצע זאת 3 פעמים (לסירוגין בין בטדין לאלכוהול), תוך ניקוי על ידי תנועה מהמרכז בצורה מעגלית לקצה. תן לאזור להתייבש באוויר.
3. צור וילון סביב אתר הניתוח באמצעות גזה סטרילית או ניילון נצמד.
4. מתוח את העור בזנב. השתמשו במאגר ביופסיה סטרילי בקוטר 6 מ"מ כדי לבצע חתך ראשוני דרך האפידרמיס הגבי השמאלי. חזור על האפידרמיס הגבי הימני.
5. השתמשו במלקחיים כדי להדגיש את העור מהמרכז של אזור הפצע השמאלי. כריתה את שכבות האפידרמל והדרמל באמצעות מספריים. חזור על הפעולה באזור הפצע המסומן מימין ליצירת פצעים סימטריים של כריתתה.
6. שטוף פצעים עם 50 מיקרוליטר של מי מלח סטריליים. אפשר לאזור הניתוח ולעור הסובב להתייבש באוויר. לאחר מכן, כסו את הפצעים ואת הגב בתחבושת שקופה.
7. החזירו את העכבר לכלוב נקי. בית אחד לכל כלוב.
8. הנח את הכלוב על כרית חימום ומסך עד שהעכבר יתעורר.
9. בעת ביצוע הניתוח הנ״ל על מספר בעלי חיים, השתמש בחומר חיטוי חרוזים חמים לניקוי כל כלי הניתוח בין בעלי החיים.
10. יש לאפשר 24 שעות לעכברים להתאושש מההליך הניתוחי וליצירת מטריצת פצע זמנית מעל הפצעים לפני המשך החיסון בחיידקים.

5. חיסון ב-P. aeruginosa

1. דילל תרבית PAO1:lux בלילה ל-OD600 = 0.05 ב-75 מ"ל של מדיום LB המכיל 100 מיקרוגרם/מ"ל קרבניצילין וגדלת את החיידקים עד שהתרבית נמצאת בשלב האקספוננציאלי המוקדם (OD₆₀₀ ≈ 0.3). זה אמור לקחת בערך 2–3 שעות.
2. PAO1 מדולל: לוקס ב-PBS לריכוז של (7.5 ± 2.5) x 10² CFU/mL. ודאו שאתם מכינים עודף חיסון כדי להבטיח נפח מספק ולאפשר את הצילוי לאחר הניסוי. אם אתה מוביל בין מתקנים (כלומר, מהמעבדה לויווריום), השתמש בכליאה כפולה בקופסה חסינה לדליפות המסומנת בבירור Biohazard.
3. בצע את כל העבודה עם P. aeruginosa ועכברים באמצעות ציוד מגן אישי מאושר בארון בטיחות ביולוגית (BSC) מאושר ברמת בטיחות ביולוגית לבעלי חיים ברמה 2 (ABSL-2). ציוד רב-פעמי, כמו משקל משקל, צריך להיות מכוסה בניילון נצמד כדי למנוע זיהום.
4. הרדמה באמצעות איזופלורן 3% כפי שתואר לעיל. שקלו את העכבר ורשמו את המשקל. הזרקו לעכבר תת-עורית נתרן כלוריד 0.9% סטרילי מחומם מראש, 250 מיקרוליטר בכל צד, לסך כולל של 500 מיקרוליטר.
5. אם הסרט השקוף של העכבר הוסר במהלך הלילה, הסר בזהירות כל גלד שנוצר והניח תחבושת חדשה.
6. השתמש במזרק בטיחות טוברקולין 27 גרם בנפח 500 מיקרולטר כדי להזריק 40 מיקרוליטר של מתליית PAO1:lux דרך תחבושת הסרט השקוף לכל פצע. יש להשתמש בעכברים שונים לבקרת פצעים לא מחוסנים/PBS כדי למנוע זיהום צולב מהצד הנגדי.
7. החזר את העכבר לכלוב שלו על כרית חימום ומוניטור עד שיתעורר. כל העכברים צריכים להיות מאוחסנים בכלובים נפרדים כדי למנוע זיהום צולב.
8. הספקו משחת תוסף תזונה עתיר קלוריות בין כדורי מזון על רצפת הכלוב.
9. השתמשו בשאר החיסון כדי לפזר צלחת אגר LB. ספירת מושבות כדי לאשר את מספר החיידקים שניתנו.

6. הדמיה ב-invivo של פצעים מזוהמים

1. עקבו אחר פרוטוקולי הכלה של BSL-2 להובלת עכברים אל וממכשיר ההדמיה, כולל שימוש במיכל משני. יש להיזהר לא להעביר או להפיל מצעים של בעלי חיים במהלך העברת העכבר לתא האינדוקציה או למכשיר ההדמיה.
2. השרה הרדמה לעכבר עם איזופלוראן שנשאף 1% – 3% בתא השראה.
3. לאחר שהעכבר נרדם, יש להניח אותו במצב שכיבה בתא ההדמיה של מערכת הדמיה אופטית, כאשר האף נמצא בקונוס האף האיזופלורן.
4. פתח את תוכנת התוכנה.
5. פרמטרי הרכישה ישתנו בהתאם למספר בעלי החיים שצולמו בו-זמנית ולעוצמת הביולומינצנציה. הפרמטרים הבסיסיים שיש להגדיר כוללים את זמן החשיפה, ה-binning, f/stop ושדה ראייה (FOV). הגדרות ההתחלה ברירת המחדל שלנו הן זמן חשיפה 30 שניות, חשיפה נמוכה (2), f/stop 1.2, ושדה ראייה 25. התאימו את ההגדרות לפי הצורך, בהתאם לצרכי החוקר.
6. נתח נתוני זוהר באמצעות תוכנת הדמיה. זוהר יוצג כתמונה פסאודו-צבעונית המונחת על צילום צבעוני של העכברים.
   1. צור אזור עניין (ROI) באתר הפצע ומדד את השטף הממוצע (פוטונים לשנייה) שזוהה. יש לשים לב שניתן גם לדווח על נתונים כקרינה (פוטונים לשנייה/ס"מ²/סטרדיאן), אך כל עוד המרחק בין פלטפורמת ההדמיה למצלמה נשאר קבוע בין ההדמיה, השטף מספיק.
   2. מדוד את הרקע על ידי יצירת ROI באזור אקראי בפלטפורמת ההדמיה. מחסר את מספר הפוטונים ברקע לשנייה.
   3. ייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני לניתוח נוסף.
7. בצע הדמיה כפי שתואר לעיל לעיתים קרובות וביום כדי לעקוב אחר התקדמות הזיהום.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
הזרקת כלוריד נתרן של 0.9%	הוספירה	2484457
מחט סטרילית בגודל 18 G x 1	BD	305195
מחט סטרילית 25 G x 1 1/5	BD	305127
מטוש אלכוהול	BD	326895
תוכנת הדמיית אאורה	הדמיית מכשירים ספקטרליים	לא זמין
בטדין	חברת פרדו פרדריק	19-065534
מעבדת בופרנורפין SR	זופארם	לא זמין
עכברים זכרים C57BL/6J	מעבדת ג'קסון	664
מאגר ביופסיה חד-פעמי, 6 מ"מ	אינטגרה	33-36
מספריים עדינים - קרביד טונגסטן	כלי המדע המדויק	14568-09
חיטוי יבש עם חרוזי זכוכית	מנגנון הרווארד	61-0183
אגר מגורגר	פישר ביוריאגנטים	BP9744
משטח חימום	מיליארדי	804879481218
מזרק אינסולין עם מחט 28 גרם	BD	329461
מערכת ההדמיה Lago X	הדמיית מכשירים ספקטרליים	לא זמין
מרק LB	פישר ביוריאגנטים	BP1426
מזרק Leur-Lok 1 מ"ל	BD	309628
גוזם חיות מיני ארקו	ווהל פרושיונל	919152
קרם הסרת שיער Nair עם שמן תינוקות	צ'רץ' ודווייט	לא זמין	זמין בכל בית מרקחת
מלקחיים מתומנים	כלי המדע המדויק	11041-08
צלחת פטרי	פלקון	351029
סליין עם בופר פוספט (PBS) פעם אחת	קורנינג	21-040-CV
ניילון לחיצה ואטום	שמח	לא זמין
מזרק אינסולין SafetyGlide עם מחט 30 גרם	BD	305934
מזרק אינסולין Safetyglide, 1/2 מ"ל, 30 גרם x 5/16 TW	BD	305934
קנה מידה	אוהאוס סקאוט פרו	SP202
תוסף תזונה סופליקל	הנרי שיין בריאות בעלי חיים	29908
טגאדרם, 6 ס"מ על 7 ס"מ	3M	1624W