קביעת אוכלוסיית חיידקים מוגדרת במעיים ביתושים בוגרים

תקציר

מקור: ליו, X. ואחרים. בדיקת האכלה חיידקית דרך הפה עם יתושים שטופלו באנטיביוטיקה. J. Vis. Exp. (2020)

הסרטון הזה מדגים את הפחתה של מיקרוביום המעי הטבעי ביתושים באמצעות תמיסת סוכרוז המכילה אנטיביוטיקה. לאחר מכן מתבצעת התיישבות מבוקרת עם השעיה חיידקית המועברת דרך מערכת הזנה ממברנלית ליצירת אוכלוסיית חיידקים מוגדרת במעי היתושים.

פרוטוקול

1. טיפול אנטיביוטי והחזרת חיידקים

1. הכינו את תמיסת האנטיביוטיקה.
   1. שקלו את הכמות הנדרשת של סוכרוז, פניצילין וסטרפטומיצין להכנת תמיסת סוכרוז של 10% הכוללת 20 יחידות פניצילין ו-20 מיקרוגרם סטרפטומיצין למ"ל.
2. האכיל יתושים בתמיסת האנטיביוטיקה.
   1. הרדימו את היתושים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 3–5 דקות. העבר את היתושים לכוס נייר. כסו את החלק העליון בגזה וסגרו את הגזה בסרט דבק כדי למנוע יתושים לברוח.
   2. טבלו כדורי כותנה סטריליים בתמיסת האנטיביוטיקה והניחו אותם בזהירות על היתושים. סחטו את כדורי הכותנה לפני השימוש כדי למנוע מהיתושים לטבוע בכדורי הכותנה המטפטפים.
   3. כסו את כדורי הכותנה בצלחת פטרי בגודל 10 ס"מ כדי למנוע אידוי לחות. החלף את כדורי הכותנה פעמיים ביום במשך שלושה ימים רצופים.
3. הכנת השעיה חיידקית
4. מדוד את תמיסת החיידקים עם ספקטרופוטומטר. הוסף 1 מתלה חיידקי OD (OD₆₀₀₀) לצינור של 1 מ"ל. צנטריפוגה את המתלים ב-5,000 x g למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
5. השליכו את הסופרנטנט והוסיפו 1 מ"ל של בופר PBS סטרילי 1x לצינור של 1.5 מ"ל לצורך שקיעת תלייה.
6. צנטריפוגה ב-5,000 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס; השליכו את הסופרנטנט.
7. חזור על השלבים 2.4.2 ו-2.4.3.
8. הוסף 200 מיקרוליטר של בופר מלח סטרילי 1x מפושט-פוספט (PBS) למשקעים החיידקיים.
9. מוסיפים 600 מיקרוליטר של 10% סוכרוז, 200 מיקרוליטר של 10 מ"מ אדנוזין 5′-טריפוספט (ATP), הפועל כפגוסטימולנט, ו-200 מיקרוליטר של תמיסת חיידקים לצינור סטרילי בנפח 1.5 מ"ל. ערבב על ידי מערבב.
10. האכיל את היתוש עם תליית החיידקים.
    1. להרעיב את היתושים במשך 24 שעות, כדי לאפשר לאנטיביוטיקה לעבור מטבוליזם לפני האכלת חיידקים.
    2. הרכיבו את מערכת ההזנה באמצעות ממברנה.
    3. אוטום את יחידת ההזנה המעוטרת עם פרפילם או לחלופין, ממברנת קולגן.
    4. שים טבעת פלסטיק וקבע אותה עם פרפילם כדי למנוע שבירה מחיכוך בזמן האכלה.
    5. הוסיפו לאט את תמיסת החיידקים המוכנה ליחידת ההזנה.
       הערה: רק באר אחת ביחידת ההזנה עם שתי בארות יכולה להתמלא בתמיסה, והיא מכסה את יחידת ההזנה רק מצד ההטלת המגבה.
    6. חבר את יחידת ההזנה למערכת האכלה מחוממת מראש ל-37 מעלות צלזיוס, המדמה את טמפרטורת האדם כדי למשוך יתושים. הנח את מכשיר ההאכלה על נייר מלאה ביתושים והאכיל במשך 90 דקות.
    7. לאחר האכלה, הרדימו את היתושים על ידי חשיפתם לטמפרטורה של 4°C למשך 3–5 דקות ושמרו על היתושים מרדימים בצלחת פטרי קרה כקרח.
    8. לקטוף את היתושים הנפוחים במלואם למחקרים נוספים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אדנוזין 5′-טריפוספט די-סודיום מלח הידראט	סיגמא	A2383	אדנוזין 5′-טריפוספט די-נתרן מלח הידראט שימש להכנת תמיסות סטנדרטיות של אדנוזין טריפוספט (ATP)
מערכת הזנת ממברנת המוטק	המוטק		רכיבי מערכת ההזנה, כולל בקר טמפרטורה של המוטק, מכלול בית הזנה, ומזין מתכתי מורכב.
פאראפילם	סאנגון ביוטק	F104002	4 אינץ' x 125 רגל
צלחת פטרי	סאנגון ביוטק	F611203
פניצילין G פרוקאין מלח הידראט	סאנגון ביוטק	A606248	אבקה לבנה. מסיס במים, מסיס במתנול, מעט מסיס במים, אתנול
סטרפטומיצין סולפט	סאנגון ביוטק	A610494	סטרפטומיצין סולפט הוא אנטיביוטיקה גלוקוזאמינית שמפריעה לסינתזת חלבונים פרוקריוטיים.
סוקרוזה	סאנגון ביוטק	A502792	מסיס במים, אתנול ומתנול, מעט מסיס בגליצרול ופירידין.
10X PBS buffer	סאנגון ביוטק	E607016	המוצר הזה הוא פתרון של 10X. אנא דילל אותו 10 פעמים לפני השימוש. ערך ה-pH הוא 7.4.